4. Bố cục đề tài
2.4.4. Phương pháp thử nghiệm cao chiết trên mơ hình chuột viêm-dị ứng phổi
phổi
a. Thiết lập mơ hình hen suyễn và điều trị
Mơ hình thí nghiệm được mơ tả như sơ đồ 2.2.
(1) Nạve: nhĩm đối chứng sinh lý (2) OVA: đối chứng âm
(3) PVE50: điều trị bằng PVE liều lượng 50 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(4) PVE100: điều trị bằng PVE liều lượng 100 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(5) PVE200: điều trị bằng PVE liều lượng 200 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(6) Dex: đối chứng dương
Chuột ở các nhĩm 2, 3, 4, 5, 6 được tiến hành gây bệnh:
+ Tiêm (sensitization) màng bụng lần đầu vào ngày 1, lần 2 vào ngày 14 của đợt thí nghiệm.
+ Xơng hơi đường mũi (challenge) từ ngày 27 đến ngày 29 bởi ovalbumin (OVA) 5% 1 lần trong ngày.
Sau gây bệnh, chuột được điều trị liên tiếp trong 12 ngày (từ ngày 15 đến ngày 26).
+ Nhĩm 2 được cho uống nước muối sinh lý.
+ Nhĩm 3, 4, 5 được cho uống cao chiết thuốc Thượng (PVE) lần lượt với liều lượng 50, 100 và 200mg/kg trọng lượng chuột.
+ Nhĩm 6 uống 2,5mg/kg Dexamethaxone (Dex).
Riêng nhĩm 1 (Nạve) chỉ dùng để làm đối chứng sinh lý, khơng tiêm OVA và khơng điều trị.
Sơ đồ 2.2. Mơ hình hen suyễn và điều trị
b. Thu dịch phổi (BALF) và đếm các loại tế bào
được thu và quay ly tâm (centrifuge) để thu serum. Dịch phổi được thu thơng qua đặt ống thơng catheter từ cuống họng thơng xuống phổi, dùng xy lanh bơm nhẹ nhàng 1ml nước muối phosphate-buffered (PBS) vào khoang phổi, xoa bĩp nhẹ nhàng bên ngồi phổi và rút dịch ra. Dịch phổi được quay ly tâm ở 10.000 vịng/phút, 40C, cặn tế bào được giữ lại cho việc quan sát và đếm tổng tế bào bởi hemocytometer, và dịch nổi được lưu giữ ở -700C cho việc kiểm tra các cytokine. 150 µl dịch phổi được quay ly tâm trên slide (1000 vịng/phút, 10 phút, 40C) cho việc đếm các tế bào viêm khác nhau. Các slide được nhuộm bằng thuốc nhuộm Diff - Quick cho việc quan sát và đếm tế bào.
c. Nhuộm và quan sát mơ phổi
Mơ phổi được thu và cố định trong dung dịch formalin trung tính 10%. Sau đĩ mơ được rửa qua đêm dưới vịi nước chảy để loại bỏ formalin, tiếp đến mơ được ngâm lần lượt trong ethanol 70%, 95%, 100% trong thời gian 45 phút cho mỗi lần ngâm để loại trừ nước ra khỏi mơ. Cuối cùng mơ được ngâm lần lượt trong dung dịch xylen 95% và xylen 100% trong thời gian 30 phút để loại trừ ethanol. Mơ phổi sau đĩ được ủ qua đêm với dung dịch paraffin trong tủ ấm, đĩng khuơn paraffin, cắt lát và dán vào slide với độ dày 4µm bởi máy cắt mơ microtome. Các slide mẫu được nhuộm với thuốc nhuộm Hematoxylin and Eosin (H&E), Periodic Acid-Schiff (PAS), and Masson Trichrome để đánh giá sự thay đổi cấu trúc chung, sự tiết dịch và xơ hĩa của phổi.
d. Đo kháng thể đặc hiệu OVA và sản phẩm tiết của các tế bào T biệt hĩa trong dịch phổi
Dịch phổi và máu được quay ly tâm để thu phần dịch nổi. Dịch nổi từ dịch phổi được bảo quản ở -750C để đo các sản phẩm tiết tế bào. Dịch nổi từ máu (serum) được bảo quản -750C để đo các kháng thể đặc hiệu OVA. Các sản phẩm tiết tế bào như IL 4, IL 5, IL12, IL-13, GATA 3, IFN-γ và các kháng thể đặc hiệu OVA bao gồm OVA- specific IgE, OVA-specific IgG1, OVA-specific IgG2a được đo bởi phương pháp Elisa theo các bước hướng dẫn của nhà sản xuất.
Các bước lần lượt được mơ tả như sau, serum và dịch phổi cùng các dung dịch chuẩn được cho vào đĩa 96 giếng đã được bao phủ bởi monoclonal antibodies và ủ đĩa ở nhiệt độ phịng khoảng 2 giờ, sau đĩ rửa sạch các giếng bởi dung dịch rửa được cung cấp trong bộ kit, horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody được thêm vào mỗi giếng, và tiếp tục ủ ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ. Sau khi loại bỏ secondary antibody, một dung dịch cơ chất cho phản ứng enzyme được thêm vào các giếng, mẫu tiếp tục được ủ 30 phút trong bĩng tối, phản ứng được dừng lại bởi thêm dung dịch stop solution vào mỗi giếng. Độ hấp thụ được đo ở bước sĩng 450 nm bằng máy đọc Elisa microplate reader.