4. Bố cục đề tài
2.4.3. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn và xác định hoạt tính kháng khuẩn
a. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy
Dụng cụ: Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác 250 ml, cốc thủy tinh 250 ml, pipet các loại, ống đong, phễu thủy tinh, giấy lọc, giấy bao gĩi, bơng khơng thấm nước, bơng y tế, đèn cồn.
Mơi trường nuơi cấy LB
Cân chính xác các thành phần trong mơi trường bằng cân kĩ thuật, pha với nước cất, xong cho vào lị vi sĩng nấu tan agar. Điều chỉnh pH bằng dung dịch kiềm. Đổ vào chai 500ml bọc giấy bạc, cho vào nồi hấp. Đợi 1h30’ đổ mơi trường ra đĩa petri.
- Các vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus được nuơi cấy trên mơi trường LB. Cơng thức pha chế mơi trường được minh họa trong bảng 2 phần phụ lục.
- Kháng sinh đồ được thực hiện trên mơi trường thạch Mueller Hinton (MHA). Cơng thức pha chế mơi trường được minh họa trong bảng 1 phần phụ lục.
b. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn
Mẫu vi khuẩn sau khi lấy về từ đơn vị cung cấp, được cấy chuyển ngay trong vịng 24 giờ để đảm sức sống vi khuẩn và tính chính xác của thí nghiệm thử hoạt tính. Quá trình nuơi cấy được thực hiện trong mơi trường LB. Dùng que cấy vơ trùng nhúng vào dịch mẫu để cĩ các vi khuẩn muốn nuơi cấy. Ria các đường trên đĩa petri cĩ chứa mơi trường thạch thích hợp, sau đĩ quay 1800 và ria lại . Sau mỗi đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo. Lật ngược đĩa và ủ trong tủ ấm trong 24h -72h.
c. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đĩ, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kính vịng ức chế vi sinh vật (ĐK) theo cơng thức ĐK (mm) = D – d, với D là đường kính vịng vơ khuẩn và d là đường kính lỗ chứa dịch cao chiết hoặc khoanh giấy kháng sinh. Dịch chiết hoặc kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch cĩ chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh [11]. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình để xác định đường kính vịng ức
chế.
Cách tiến hành: Cho vào mỗi đĩa 25 ml mơi trường LB vơ trùng. Mỗi đĩa peptri đục 6 giếng thạch với đường kính 3 mm gồm:
- 4 giếng chứa 100µl dịch cao chiết từ lá thuốc Thượng với các nồng độ lần lượt là 100, 200, 400, 600, 800 mg/ml.
- 1 giếng chứng 100µl DMSO 5% vơ trùng
- 1 giếng chứa kháng sinh đối chứng đặt ở trung tâm.
Các đĩa mẫu chứa 3 chủng vi khuẩn gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.
Để vào tủ lạnh 5 – 10 giờ cho kháng sinh, dịch chiết được khuếch tán rồi nuơi cấy ở nhiệt độ 28-300 C. Đọc kết quả sau 24 giờ.
d. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
Hút 0,2 ml dịch vi khuẩn nồng độ đã được chọn từ trước vào ống nghiệm chứa mơi trường LB lỏng, hút thêm 0,2 ml nước cất vơ trùng vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường nuơi cấy và dịch vi khuẩn. Lắc kỹ ống nghiệm. Nuơi hỗn hợp trên trong vịng 24 giờ ở 37°C.
Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp của các chủng vi khuẩn, hút 0,2 ml dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường nuơi cấy lỏng, hút thêm 0,2 ml dịch cao chiết vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường nuơi cấy và dịch vi khuẩn phân phối từ nồng độ cao chiết từ thấp nhất đến nồng độ cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm. Hút 0,1 ml dịch trong mỗi ống nghiệm cấy trang lên đĩa thạch chứa mơi trường LB rắn và tiếp tục đặt vào tủ ấm 37 °C trong 24 giờ.
Nuơi hỗn hợp ở các ống nghiệm trên trong vịng 12 giờ quan sát độ đục từng ống nghiệm. Chú ý quan sát ống nghiệm chứa chứng âm trước nếu thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục cấy, nếu khơng phải làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc cĩ trên đĩa thạch chứa mơi trường LB. Đĩa cĩ số khuẩn lạc 1-3 khuẩn lạc/đĩa là đĩa cĩ nồng độ tối thiểu của cao chiết ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC). Những đĩa khơng khơng cĩ sự phát triển của khuẩn lạc với nồng độ gần nồng độ ức chế tối thiểu nhất được xác định là đĩa chứa nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).