dược điển Việt Nam IV.
1. Chiết suất cao dược liệu
Chiết xuất hoa đu đủ đực với dung môi ethanol. Dịch chiết thu được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% thu được chế phẩm cao đặc hoa đu đủ đực.
2. Mô tả cảm quan
Về màu sắc và độ quánh: lấy 1 gam cao cồn đặc hoa đu đủ đực cho vào đĩa petri, quan sát dưới ánh sáng tự nhiên. Đánh giá về màu sắc và độ quánh của chế phẩm.
- Về độ tan và mùi vị: Lấy 1 gam cao cồn đặc hoa đu đủ đực hòa tan với 500 mL nước nóng, quan sát độ hòa tan, sau đó thử để đánh giá về mùi và vị của chế phẩm.
3. Xác định hàm lượng cặn không tan trong nước
Hòa tan 1 gam cao cồn đặc hoa đu đủ đực trong 150 mL nước cất, để lắng trong vòng 24 giờ. Tiến hành hút phần dịch lọc bên trên đến gần cạn. Cho tiếp vào 150 mL nước cất để lắng trong vòng 4 – 6 giờ, tiếp tục hút phần dịch lọc bên trên, lặp lại tương tự thí nghiệm như trên cho đến khi dịch lọc trong. Tiến hành ly tâm để thu phần cặn, sấy khô cặn ở 100 – 1050C đến khối lượng không đổi. Xác định phần trăm khối lượng cặn không tan trong nước theo công thức:
25 C (%) = mcặn
mmẫu x 100%
4. Xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6 – DĐVN IV)
Dùng dụng cụ sấy bằng thủy tinh rộng miệng, đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phương pháp và điều kiện quy định trong chuyên luận rồi cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một lượng chính xác mẫu thử bằng khối lượng quy định trong chuyên luận với sai số ± 10 %. Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì lượng mẫu thử được dàn mỏng thành lớp có độ dày không quá 5 mm. Tiến hành làm khô trong điều kiện quy định của chuyên luận. Nếu dùng phương pháp sấy thì nhiệt độ thực cho phép chênh lệch ±2 oC so với nhiệt độ quy định. Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng, trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay. Nếu chỉ dẫn không quy định thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lượng không đổi, tức là sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoặc 6 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg. Xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm khô theo công thức:
W (%) = mcặn-mmẫu sau khi làm khô
mmẫu x 100%
5. Xác định hàm lượng tro toàn phần (Phụ lục 9.8 – DĐVN IV)
Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 gam mẫu cao đặc hoa đu đủ đực cho vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100oC đến 105oC rồi đem nung trong lò nung ở 450 – 550oC ± 25oC. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không để tạo thành ngọn lửa. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi. Xác định tro toàn phần theo công thức:
T % = mcốc và mẫu tro hóa - mcốc
mmẫu x 100%
6. Kim loại nặng
Mẫu cao đặc hoa đu đủ đực sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL. Lấy dung dịch đã định mức tiến
26
hành xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
7. Độ pH (Phụ lục 6.2 – DĐVN IV)
Lấy 1 gam cao cồn đặc hoa đu đủ đực hòa tan vào 100 mL nước cất và tiến hành đo pH bằng máy đo pH.
8. Định tính một số lớp chất a, Định tính alkaloid
Cân 5 gam bột hoa đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 950 : dung dịch amonia đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có tính base. Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn.
Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan phần cặn trong dung dịch hydrochloric acid 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử với ba loại thuốc thử Mayer, Wagner và Dragendroff.
b, Định tính flavonoid
Ngâm 5 gam bột hoa đu đủ đực trong dung môi ethanol, lọc lấy dịch. Cho 1mL dịch lọc vào ống nghiệm rồi đem thử bằng các phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch sunfuric acid đậm đặc: Thêm vài giọt dung dịch sunfuric acid đậm đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc. Nếu là flavon, isoflavon, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam; chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ; flavonon cho màu từ cam đến đỏ .
- Phản ứng với dung dịch sodium hydroxide 1%: Thêm vài giọt dung dich Sodium hydroxide 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng; flavonol cho màu từ vàng đến cam; auron cho màu tím đến đỏ tím.
c, Định tính coumarin
Ngâm 5 gam bột hoa đu đủ đực trong 50mL ethanol, lọc lấy dịch lọc, cho 2 – 3mL dịch lọc vào 2 ống nghiệm và thử bằng phản ứng mở đóng vòng lacton
27 Ống 2: giữ nguyên.
Sau đó đun cách thủy cả 2 ống trong vài phút, để nguội thêm vào mỗi ống 4mL nước cất, nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa bằng acid sunfuricloãng mà ống 1 đục hơn ống 2 thì có coumarin.
d, Định tính saponin
Cân 1 gam bột hoa đu đủ đực, cho vào cốc và 5mL ethanol đun cách thủy 5 phút, lọc lấy dung dịch ethanol để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích thước bằng nhau.
Ống 1: 5mL hydrochloric acid 0,1N (pH = 1) + 3 giọt dung dịch ethanol chứa mẫu thử.
Ống 2: 5mL sodium hydroxide 0,1N (pH = 13) + 3 giọt dung dịch ethanol chứa mẫu thử.
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:
- Nếu cột bọt trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống 2 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid.
e, Định tính đường khử
Ngâm 2 gam bột hoa đu đủ đực trong 10mL chloroform, lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, cho 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B, sau đó đun cách thủy, nếu có đường khử thì xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
f, Định tính polyphenol
Ngâm 2 gam bột hoa đu đủ đực trong 10mL methanol hoặc ethanol, lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch sắt (III) chloride 1%. Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm thì có polyphenol.
g, Định tính steroid
- Phản ứng Libermann – Burchard: Cho vào ống nghiệm 1mL acetic anhydride, 1mL chloraform, làm lạnh ống nghiệm và thêm vài giọt sunfuric acid đậm đặc, sau đó
28
cho dịch lọc ngâm trong chloroform, nếu dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu bền không đổi thì có steroid.
- Phản ứng Salkowski: Ngâm 2 gam bột hoa đu đủ trong chloroform. Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt sunfuric acid đậm đặc, phản ứng dương tính là dung dịch chuyển thành màu đỏ đậm, xanh, xanh – tím.
i, Định tính acid hữu cơ
Cân 3 gam cao đặc hoa đu đủ đực cho vào cốc, thêm 10mL nước cất đem đun sôi 10 phút. Để nguội, đem lọc lấy dịch. Cho 2-3mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1 ít tinh thể sodium carbonate. Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra có acid hữu cơ.
k, Định tính chất béo
Ngâm 3 gam bột hoa đu đủ đực trong 10mL n-hexane trong 1 giờ. Lọc lấy dịch loc, sau đó nhỏ vài giọt dịch lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, nếu có vết mờ trên giấy có chất béo.
l, Định tính carotene
Ngâm 2 gam hoa đu đủ đực trong 10mL n-hexane trong 15 phút, lọc lấy dịch lọc và cho 2mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy thu lấy cặn, sau đó nhỏ vài giọt sunfuric acid đậm đặc lắc nhẹ, thấy xuất hiện màu xanh lá thì có carotene.
9. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế ATCC: 3 chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella. enterica ATCC12228), 3 chủng Gram + (Enterococcuc. faecalis ATCC13124,
Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), 1 chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 được cung cấp bởi viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia.
Các bước tiến hành: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần: 256µg/ml, 128µg/ml, 64µg/ml,
29
32µg/ml, 16µg/ml, 8µg/ml, 4µg/ml và 2µg/ml với số thí nghiệm lặp lại N=3. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×104CFU/ml.
Tiến hành thử: Lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mg/ml vào hàng đầu tiên có chứa 100l môi trường LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt được nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và được xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn. Nistatin và cyclohexamide cho nấm.
10.Hoạt tính gây độc tế báo ung thư
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi GS. Jeong-Hyung Lee, Trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc bao gồm tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (Hep3B) và tế bào ung thư vú (MCF-7).
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RMPI 1640 hoặc DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 100 U/ml penicillin, và 100 µg/ml streptomycin ở 37 ºC trong tủ ấm 5% CO2. Các tế bào được cấy chuyển vào trong phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1×105 tế bào/giếng) với và được xử lý với các nồng độ khác nhau của mẫu thử. Sau 48h ủ, thêm 20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL) vào các giếng và ủ tiếp 4h. Sau đó gạn bỏ môi trường và hòa tan tinh thể formazan trong 100 μL isopropanol và giá trị mật độ quang (OD) được đo bằng máy đọc Elisa (xMark Pro, Biorad, USA) ở bước sóng 570 nm. Camptothecin được sử dụng làm đối chứng dương. Kết quả tính được biểu diễn bằng phần trăm tế bào sống sót (CS %).
CS% = OD (mẫu thử) - OD (ngày 0)
30
CHƯƠNG 3