Mẫu hải miên R. globostellata (40 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối, ngâm chiết siêu âm với MeOH (3 lần
50 lít, mỗi lần 2h), sau khi thu được dịch chiết cất loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được 420 g cặn MeOH. Sau đó, cặn này được bô sung thêm 3 lít nước và chiết phân lớp bằng dung môi dichloromethane (2 lần
3 lít), dịch chiết dichloromethane được cất quay để loại bỏ dung môi thu được cặn chiết dichloromethane (320,0 g) và dịch nước.
Cặn chiết dichloromethane được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi độ phân cực tăng dần dichloromethane/methanol (1:0 → 0:1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn RD1 (20,0 g), RD2 (200,0 g), RD3 (60,0 g) và RD4 (35,0 g). Phân đoạn RD2 tiếp tục được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan/acetone (0-100%, tăng dần acetone) thu được 4 phân đoạn RD2A-RD2D. Phân đoạn RD2B được phân tách bằng cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi acetone/nước (2/1, v/v) thu được 5 phân đoạn, RD2B1–RD2B5. Sau đó, phân đoạn RD2B2 được tinh chế trên cột HPLC điều chế (J’sphere ODS H- 80, 250mm×20mm) với hệ dung môi rửa giải là 30 % ACN trong nước thu được hợp chất RG11 (7,3 mg, tR = 22,4 phút). Hợp chất RG6 (15.2 mg, tR = 42,3 phút) thu được từ phân đoạn RD2B4 bằng điều kiện tương tự phân đoạn RD2B2. Tiếp theo, phân đoạn RD2C được đưa lên cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi
acetone/nước (1,5/1, v/v) thu được 2 phân đoạn RD2C1-RD2C2. Phân đoạn RD2C1 được tinh chế trên cột HPLC điều chế (J’sphere ODS H-80, 250mm×20mm) với hện dung môi 65% ACN thu được hợp chất RG1 (5,9 mg, tR = 38,0 phút) và RG2 (17,5 mg, tR = 48,7 phút). Hai hợp chất RG3 (5,2 mg, tR = 34,0 phút) và RG7 (6,2 mg, tR = 58,8 phút) được điều chế từ phân đoạn RGD2C2 bằng cột HPLC với dung môi 60% ACN. Phân đoạn RD3 (60,0 g) được phân tách bằng cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi methanol/nước (3/1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn, RD3A-RD3D. Phân đoạn RD3A tiếp tục được đưa lên cột silica gel pha thường với dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1, v/v) thu được ba phân đoạn RD3A-RD3A3. Hợp chất
RG12 (5,2 mg, tR = 53,3 phút) thu được từ phân đoạn RD3A3 điều chế trên cột HPLC trong điều kiện 22% ACN trong nước. Phân đoạn RD3C được đưa lên cột sắc kí silica gel pha thường điều kiện n-hexan/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 5 phân đoạn RD3C-RD3C4. Phân đoạn RD3C1 tiếp tục được tinh chế trên cột HPLC với 70% ACN thu được hai hợp chất RG10 (5,4 mg, tR = 48,5 phút) và RG8 (5,8 mg, tR = 50,0 phút). Phân đoạn RD3C2 cũng được đưa lên cột HPLC nhưng khác hệ dung môi, ACN-H2O (95-15, v/v) thu được hợp chất RG9 (5,7 mg, tR = 51,5 phút). Hợp chấ RG4 (10,0 mg, tR = 59,14 phút) thu được từ phân đoạn RD3C3, nhưng hệ dung môi rửa giải là ACN-H2O (85-15, v/v). Cuối cùng, phân đoạn RD3C4 được đưa lên cột HPLC để tinh chế với hệ dung môi rửa giải là 70% ACN thu được hợp chất
RG5 (19,5 mg, tR = 43,7 phút).
32
A: Acetone H: n-hexan c.c: Column chromatography M: Methanol D: Dichloromethane W: Nước EtOAc: Ethyl acetate ACN: Acetonitrile HPLC: High Performance Liquid Chromatography
Rhabdastrella globostellata(40 kg tươi)
Chiết với methanol (3 lần × 50 L, 2h) Sau đó cất loại bỏ dung môi
Methanol ext. (420 g )
Bổ sung nước và chiết phân lớp với dung môi dichloromethane, sau đó cất quay loại dung môi
Cặn CH2Cl2 (320.0 g) Gradient 100% D D/M: 40/1 RD1 ( 20 g) RD2 (200 g) Silica gel c.c Gradient H/A :1/0-0/1 100% H H/A: 10/1 RD2A RD2B RP-18 c. c. A/W: 2/1 RP-18 c. c. A/W: 1.5/1 Silica gel c. c. H/A: 3/1 Silica gel c. c. H/E: 2/1 RD2B1 RD2B2 RD2B3 RD2B4 HPLC HPLC 30% ACN 30% ACN RG11 RG6 (7.3 mg) (15.2 mg) tR 22.4 tR 42.3
33