A. aaptos
3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài A.
aaptos
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào đối với 9 hợp chất phân lập được từ loài A. aaptos cho thấy hợp chất AA7 (demethyl(oxy)aaptamine) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tương đối mạnh trên các dòng tế bào ung thư LU1, MCF7, HepG2 và SKMel2 với giá trị IC50 lần lượt là 9,22 ± 0,95, 7,81 ± 0,61, 8,35 ± 0,77, 7,65 ± 0,83 μM.
Hợp chất AA3, AA4 và AA6 thể hiện hoạt tính tương đối chọn lọc trên một số dòng tế bào được ung thư được thử nghiệm. Cụ thể, so với hoạt tính của chất đối chứng dương (IC50 = 1,38 ± 0,16 ÷ 1,71 ± 0,11 µM), hợp chất AA3 và AA4 thể hiện hoạt tính tốt nhất trên dòng tế bào ung thư vú với giá trị IC50 lần lượt là 9,40 ± 1,19 và 11,49 ± 1,05 µM. Ngoài ra, hợp chất AA3 còn có hoạt tính tương đối tốt trên dòng tế bào ung thư phôi với IC50 là 11,81 ± 1,54 µM. Hợp chất AA6 có hoạt tính khá tốt trên dòng tế bào ung thư gan với IC50 là 10,61 ± 0,47 µM và thể hiện hoạt tính trung bình trên ba dòng tế bào còn lại với giá trị IC50 13,08 – 22,75 µM.
Bên cạnh đó, trong 8 hợp chất aaptamine alkaloid được thử nghiệm, 3 hợp chất
AA1, AA5 và AA8 thể hiện hoạt tính yếu nhất trên cả 4 dòng tế bào với IC50 nằm trong khoảng 34,31 – 51,42 µM. Hơn nữa, nhận thấy cấu trúc các hợp chất này đều là các aaptamine alkaloid có sự ketone hóa tại các vị trí C-2, C-3, C-5 hoặc C-6 trong nhân 1,6-naphthyridine. Điều này gợi ý rằng, sự ketone hóa trong nhân 1,6- TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
naphthyridine làm giảm hoạt tính. Hợp chất AA9 còn lại không thể hiện hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư thử nghiệm (IC50>100 µM).
Kết quả nghiên cứu về hoạt tính nêu trên khá tương đồng với kết quả nghiên cứu trước đó về hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) của hợp chất demethyl(oxy)aaptamine (AA7) [33].
131
KẾT LUẬN
Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên R. globostellata và A. aaptos thu thập ở vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa. Bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phô hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 21 hợp chất từ hai loài hải miên R. globostellata và A. aaptos ở vùng biển Nam Trung bộ Việt Nam, trong đó có 11 hợp chất mới.
1. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học
- Từ loài R. globostellata đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất (RG1- RG12): bao gồm 7 hợp chất mới RG1-RG6 và RG11 được đặt tên là:
rhabdaglostelone A-C (RG1-RG3), rhabdastrenone A-C (RG4-RG6), rhabdastrenone D (RG11) và 5 hợp chất đã biết: rhabdastrellin G (RG7), isogeoditin A (RG8), stelliferin A (RG9), 13-(E)-isogeoditin A (RG10) và 2,3- dihydro-3-hydroxy-2-methylinden-1-one (RG12).
- Từ loài A. aaptos đã phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất alkaloid (AA1- AA9), trong đó có 4 hợp chất mới: 9-methoxy-N-demethylaaptanone (AA1), 3,5-
dicarbomethoxy-1,6-naphthyridine (AA2), aaptosvanphong A (AA3), aaptosvanphong B (AA4) và 5 hợp chất đã biết: 2-methoxy-3-oxoaaptamine (AA5), (AA6), demethyl(oxy)aaptamine (AA7), 2,3-dihydro-2,3-dioxoaaptamine (AA8) và 5H,7H,9H-9S-hydroxy- imidazo[1,5-a]pyridine-1,3-dione (AA9).
2. Kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan (HepG2), ung thư phôi (LU1), ung thư vú (MCF7) và ung thư da (SKMel2) của 12 hợp chất (RG1-RG12) phân lập được từ loài hải miên R.
globostellata và 9 hợp chất (AA1-AA9) từ loài A. aaptos, kết quả cho thấy:
-Trong số 12 hợp chất từ loài R. globostellata, hợp chất RG8 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất đối với cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 trong khoảng 7,53-10,21 µM. Các hợp chất RG1-RG2, RG4-RG7 và RG9 thể hiện hoạt tính trung bình với giá trị IC50 12,91-84,82 µM. Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính trên tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm (IC50>100 µM).
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
- Trong số 9 hợp chất từ loài A. aaptos, hợp chất AA7 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 7,65-9,22 μM. Hợp chất AA9 không thể hiện hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư thử nghiệm (IC50>100 µM) và các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính ở mức độ trung bình.
133
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam.
- Phân lập và xác đinh được 7 hợp chất mới từ loài R. globostellata: rhabdaglostelone A-C (RG1-RG3), rhabdastrenone A-C (RG4-RG6), rhabdastrenone D (RG11). Các hợp chất mới RG1, RG2, RG4-RG6 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư LU1, MCF7, HepG2 và SKMel2 với giá trị IC50 từ 15.91-40,01 µM.
- Phân lập và xác định được 4 hợp chất mới từ loài A. aaptos: 9-methoxy-N-
demethylaaptanone (AA1), 3,5-dicarbomethoxy-1,6-naphthyridine (AA2), aaptosvanphong A (AA3), aaptosvanphong B (AA4). Các hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư LU1, MCF7, HepG2 và SKMel2 với giá trị IC50 từ 9,40-49,21 µM.
KIẾN NGHỊ
Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài hải miên R. globostellata và A. aaptos nêu trên cho thấy hợp chất RG8 (isogeoditin A) phân lập từ loài R. globostellata và hợp chất AA7 (demethyl(oxy)aaptamine) phân lập từ loài A. aaptos thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào ung thư LU1, MCF7, HepG2 và SKMel2. Do đó, có thể tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để làm rõ cơ chế tác động của các hợp chất đó.
135
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Do Thi Trang, Bui Huu Tai, Dan Thuy Hang, Pham Hai Yen, Phan Thi Thanh
Huong, Nguyen Xuan Nhiem, and Phan Van Kiem. Chemical Constituents of the Marine Sponge Aaptos aaptos (Schmidt, 1864) and Their Cytotoxic Activity.
Natural Product Communications, 2021, 16 (2), 1-5.
doi.org/10.1177/1934578X21993345
2.Do Thi Trang, Bui Huu Tai, Dan Thi Thuy Hang, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan
Nhiem & Phan Van Kiem. Four new aaptamine alkaloids from marine sponge
Aaptos aaptos. Natural Product Research, 2021, 1-10.
doi.org/10.1080/14786419.2021.1917572
3.Do Thi Trang, Duong Thi Dung, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Thi Cuc, Pham
Hai Yen, Dan Thi Thuy Hang, Tran My Linh, Nguyen Chi Mai, Phan Thi Thanh Huong, Bui Huu Tai, Phan Van Kiem. New tetracyclic and pentacyclic isomalabaricanes from the marine sponge Rhabdastrella globostellata (Carter, 1883). Tetrahedron Letters, 2022, 89, 153607. doi.org/10.1016/j.tetlet.2021.153607.
4. Do Thi Trang, Pham Hai Yen,Dan Thi Thuy Hang,Phan Thi Thanh Huong,
Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Duong Thi Dung, Le Thi Huyen, Nguyen Thi Cuc, and Phan Van Kiem, Nguyen Thi Mai. Rhabdastrenones A–D from the sponge
Rhabdastrella globostellata, RSC Advances, 2022, 12, 10646-10652. DOI:
10.1039/d2ra01674e
5.Phan Văn Kiệm, Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh, Nguyễn Xuân Nhiệm, Bùi Hữu Tài, Phạm Hải Yến, Dương Thị Dung, Đỗ Thị Trang, Bùi Hữu Tài, Đan Thị Thúy Hằng. Hợp chất 6/6/5/5-tetracyclic triterpene và phương pháp phân lập hợp chất này từ loài hải miên Rabdastrella globostellata. Cục sở hữu trí tuệ. Số đơn 1- 2021-05955.
137
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. R.W.M. Van Soest, N. Boury-Esnault, J. Vacelet, M. Dohrmann, D. Erpenbeck, N.J. De Voogd, N. Santodomingo, B. Vanhoorne, M. Kelly, J.N.A. Hooper, Global diversity of sponges (Porifera), PLOS ONE, 2012, 7, e35105.
2. http://www.marinespecies.org/porifera/index.php.
3. W. Bergmann, R.J. Feeney, Contributions to the study of marine products. Xxxii. The nucleosides of sponges. I.1, The Journal of Organic Chemistry, 1951, 16, 981-987.
4. F. Lv, Z. Deng, J. Li, H. Fu, R.W.M. van Soest, P. Proksch, W. Lin,
Isomalabaricane-type compounds from the marine sponge Rhabdastrella aff. distincta, Journal of Natural Products, 2004, 67, 2033-2036.
5. S. Aoki, M. Sanagawa, Y. Watanabe, A. Setiawan, M. Arai, M. Kobayashi, Novel isomarabarican triterpenes, exhibiting selective anti- proliferative activity against vascular endothelial cells, from marine sponge Rhabdastrella globostellata, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2007, 15, 4818-4828.
6. https://www.gbri.org.au/Species/Rhabdastrellaglobostellata.aspx?
Page ContentID=788.
7. W.H. Zhang, C.T. Che, Isomalabaricane-type nortriterpenoids and other constituents of the marine sponge Geodia japonica, Journal of NaturalProducts, 2001, 64, 1489-1492.
8. J.Y. Su, Y.H. Meng, L.M. Zeng, X. Fu, F.J. Schmitz, Stellettin A, a new triterpenoid pigment from the marine sponge Stelletta tenuis,
Journal ofNatural Products, 1994, 57, 1450-1451.
9. K.M. Meragelman, T.C. McKee, M.R. Boyd, New cytotoxic isomalabaricane triterpenes from the sponge Jaspis species, Journal of Natural Products, 2001, 64, 389-392.
10. Z. Rao, S. Deng, H. Wu, S. Jiang, Rhabdastrellic acid-A, a novel triterpenoid from the marine sponge Rhabdastrella globostellata,
Journal of Natural Products, 1997, 60, 1163-1164.
11. D. Tasdemir, G.C. Mangalindan, G.P. Concepción, S.M. Verbitski, S. Rabindran, M. Miranda, M. Greenstein, J.N.A. Hooper, M.K. Harper, C.M. Ireland, Bioactive isomalabaricane triterpenes from the marine sponge Rhabdastrella globostellata, Journal of Natural Products, 2002, 65, 210-214.
12. J.F. Guo, J.M. Zhou, Y. Zhang, R. Deng, J.N. Liu, G.K. Feng, Z.C. Liu, D.J. Xiao, S.Z. Deng, X.F. Zhu, Rhabdastrellic acid-A inhibited PI3K/Akt pathway and induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells, Cell Biology International, 2008, 32, 48-54.
13. M. Fouad, R.A. Edrada, R. Ebel, V. Wray, W.E.G. Müller, W.H. Lin, P. Proksch, Cytotoxic isomalabaricane triterpenes from the marine sponge Rhabdastrella globostellata, Journal of Natural Products, 2006, 69, 211-218.
14. F. Lv, M. Xu, Z. Deng, N.J. de Voogd, R.W.M. van Soest, P. Proksch, W. Lin, Rhabdastrellins A−F, Isomalabaricane triterpenes from the marine sponge Rhabdastrella aff. distincta, Journal of Natural Products,2008, 71, 1738-1741.
15. J.A. Clement, M. Li, S.M. Hecht, D.G.I. Kingston, Bioactive isomalabaricane triterpenoids from Rhabdastrella globostellata that stabilize the binding of DNA polymerase β to DNA, Journal of Natural Products, 2006, 69, 373-376.
139
16. N. Tanaka, R. Momose, A. Shibazaki, T. Gonoi, J. Fromont, J.- i. Kobayashi, Stelliferins J-N, isomalabaricane-type triterpenoids from Okinawan marine sponge Rhabdastrella cf. globostellata, Tetrahedron, 2011, 67, 6689-6696.
17. P.V. Kiem, D.T. Dung, P.H. Yen, N.X. Nhiem, T.H. Quang, B.H. Tai, C.V. Minh, New isomalabaricane analogues from the sponge Rhabdastrella providentiae and their cytotoxic activities, Phytochem. Lett., 2018, 26, 199-204.
18. J. Li, B. Xu, J. Cui, Z. Deng, N.J. de Voogd, P. Proksch, W. Lin,
Globostelletins A–I, cytotoxic isomalabaricane derivatives from the marine sponge Rhabdastrella globostellata, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, 18, 4639-4647.
19. M. Hirashima, K. Tsuda, T. Hamada, H. Okamura, T. Furukawa, S.-i. Akiyama, Y. Tajitsu, R. Ikeda, M. Komatsu, M. Doe, Y. Morimoto, M. Shiro, R.W.M. van Soest, K. Takemura, T. Iwagawa,
Cytotoxic isomalabaricane derivatives and a monocyclic triterpene glycoside from the sponge Rhabdastrella globostellata, Journal of Natural Products,2010, 73, 1512-1518.
20. J. Li, H. Zhu, J. Ren, Z. Deng, N.J.d. Voogd, P. Proksch, W. Lin, Globostelletins J–S, isomalabaricanes with unusual cyclopentane sidechains from the marine sponge Rhabdastrella globostellata,
Tetrahedron, 2012, 68, 559-565.
21. M.-L. Bourguet-Kondracki, A. Longeon, C. Debitus, M. Guyot,
New cytotoxic isomalabaricane-type sesterterpenes from the new Caledonian marine sponge Rhabdastrella globostellata, Tetrahedron Letters, , 2000,41, 3087-3090.
22. D.T. Dung, P.H. Yen, X.N. Nguyen, T.H. Quang, B.H. Tai, C. Van Minh, D.C. Kim, H. Oh, Y.C. Kim, V.K. Phan, New acetylated
terpenoids from sponge Rhabdastrella providentiae inhibit NO production in LPS stimulated BV2 cells, Natural Product Communications, 2018, 13, 1934578X1801300602.
23. D.T. Dung, D.T.T. Hang, N.X. Nhiem, T.H. Quang, B.H. Tai, P.H. Yen, N.T. Hoai, D.C. Thung, C.V. Minh, P.V. Kiem,
Rhabdaprovidines D-G, four new 6,6,5-tricyclic terpenoids from the Vietnamese sponge Rhabdastrella providentiae, Natural Product Communications, 2018, 13, 1934578X1801301004.
24. M.D.S. Carvalho, S.M. Da Silva, U. Pinheiro, Two new species of Aaptos (Demospongiae, Hadromerida) from Brazil (western Atlantic),
Zootaxa, 2013, 3750, 357-366.
25. D.X. Cuong, V.N. Boi, T.K.T. Nhan, D.H. Dong, T.M. Quang, P.T.K. Tram, D.T.T. Tuyen, Polyphenol content, phytochemistry compositions and antioxidant activity of different extracts from marine sponge Aaptos suberitoides grown in Nhatrang Bay, Vietnam,
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2019, 11, 80-86.
26. L.K. Shubina, A.I. Kalinovsky, S.N. Fedorov, O.S. Radchenko, V.A. Denisenko, P.S. Dmitrenok, S.A. Dyshlovoy, V.B. Krasokhin, V.A. Stonik, Aaptamine alkaloids from the Vietnamese sponge Aaptos sp,
Natural Product Communications, 2009, 4, 1085-1088.
27. N.K. Utkina, V.A. Denisenko, M.A. Pushilin, Aaptanone, a novel zwitterionic metabolite of the aaptamine class with an oxygenated 1,6-naphthyridine core from the Vietnamese marine sponge Aaptos aaptos, Tetrahedron Letters, , 2009, 50, 2580-2582.
28. N.K. Utkina, V.A. Denisenko, N-Demethylaaptanone, A new congener
of aaptamine alkaloids from the Vietnamese marine sponge Aaptos aaptos, Natural Product Communications, 2016, 11,
29. H. Nakamura, J.i. Kobayashi, Y. Ohizumi, Y. Hirata, Isolation and structure of aaptamine a novel heteroaromatic substance possessing α-blocking activity from the sea sponge Aaptos aaptos, Tetrahedron Letters, 1982, 23, 5555-5558.
30. H. Nakamura, J.i. Kobayashi, Y. Ohizumi, Y. Hirata,
Aaptamines. Novel benzo[de][1,6]naphthyridines from the Okinawan marine sponge Aaptos aaptos, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 1987,173-176.
31. A. Rudi, Y. Kashman, Aaptosine - a new cytotoxic 5,8- diazabenz[cd]azulene alkaloid from the Red Sea sponge Aaptos aaptos,
Tetrahedron Letters, 1993, 34, 4683-4684.
32. W.F. Tinto, Aaptosamine, a new 5,8-diazabenz[cd]azulene alkaloid from the Caribbean sponge Aaptos aaptos. An unprecedented base-catalyzed rearrangement of 9-demethyloxyaaptamine,
Heterocycles, 1998, 48,2089-2093.
33. J.-H. Gan, W.-Z. Hu, H.-B. Yu, F. Yang, M.-X. Cao, H.-J. Shi, Y.-F. Kang, B.-N. Han, Three new aaptamine derivatives from the South China Sea sponge Aaptos aaptos, Journal of Asian Natural Product Research, 2015, 17, 1231-1238.
34. L. Calcul, A. Longeon, A.A. Mourabit, M. Guyot, M.-L. Bourguet-Kondracki, Novel alkaloids of the aaptamine class from an Indonesian marine sponge of the genus Xestospongia, Tetrahedron, 2003, 59, 6539-6544.
35. A.F. Coutinho, B. Chanas, T.M.L. e Souza, I.C.P.P. Frugrulhetti, R.d.A. Epifanio, Anti HSV-1 alkaloids from a feeding deterrent marine sponge of the genus Aaptos, Heterocycles, 2002, 57, 1265-1272.
142
36. A. Herlt, L. Mander, W. Rombang, R. Rumampuk, S. Soemitro, W. Steglich, P. Tarigan, F. von Nussbaum, Alkaloids from marine organisms. Part 8: Isolation of bisdemethylaaptamine and bisdemethylaaptamine-9-O-sulfate from an Indonesian Aaptos sp. marine sponge, Tetrahedron, 2004, 60, 6101-6104.
37. K.H. Jang, S.C. Chung, J. Shin, S.H. Lee, T.I. Kim, H.-S. Lee, K.B. Oh, Aaptamines as sortase A inhibitors from the tropical sponge Aaptos aaptos, Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2007, 17, 5366- 5369.
38. H.B. Yu, F. Yang, F. Sun, G.Y. Ma, J.H. Gan, W.Z. Hu, B.N. Han, W.H. Jiao, H.W. Lin, Cytotoxic aaptamine derivatives from the South China Sea sponge Aaptos aaptos, Journal of Natural Products, 2014, 77, 2124-2129.
39. M. Arai, C. Han, Y. Yamano, A. Setiawan, M. Kobayashi,
Aaptamines, marine spongean alkaloids, as anti-dormant mycobacterial substances, Journal of Natural Medicine, 2014, 68, 372-376.
40. T. Hamada, Y. Matsumoto, C.S. Phan, T. Kamada, S. Onitsuka, H. Okamura, T. Iwagawa, N. Arima, F. Tani, C.S. Vairappan, Aaptamine- related alkaloid from the marine sponge Aaptos aaptos, Natural Product Communications, 2019, 14, 1934578X19863935.
41. C.D. Pham, R. Hartmann, W.E.G. Mueller, N. de Voogd, D. Lai, P. Proksch, Aaptamine derivatives from the Indonesian sponge Aaptos suberitoides, Journal of Natural Products, 2013, 76, 103-106.
42. K. Shaari, K.C. Ling, Z. Mat Rashid, T.P. Jean, F. Abas, S.M. Raof, Z. Zainal, N.H. Lajis, H. Mohamad, A.M. Ali, Cytotoxic aaptamines from Malaysian Aaptos aaptos, Marine Drugs, 2009, 7, 1-8.
43. M.R. Zalilawati, Y. Andriani, K. Shaari, N. Bourgougnon, A.M. Ali, T.S.T. Muhammad, H. Mohamad, Induction of apoptosis and anti HSV-1
143
activity of 3-(phenethylamino)demethyl(oxy)aaptamine from a Malaysian Aaptos aaptos, Journal Chemistry Pharmaceutical Research, 2015, 7, 330-341.
44. C. Liu, X. Tang, P. Li, G. Li, Suberitine A-D, Four new cytotoxic dimeric aaptamine alkaloids from the marine sponge Aaptos suberitoides, Organic Letters, 2012, 14, 1994-1997.
45. K. Gong, S. Miao, L. Yang, Y. Wu, J. Guo, W. Chen, J. Dai, J. Du, S. Xi, Aaptamine attenuates the proliferation and progression of non-small cell lung carcinoma, Pharmaceutical Biology (Abingdon, U. K.), 2020, 58, 1044-1054.
46. V.M. Nadar, S. Manivannan, R. Chinnaiyan, M. Govarthanan, K. Ponnuchamy, Review on marine sponge alkaloid, aaptamine: A potential antibacterial and anticancer drug, Chemical Biology & Drug Design.2021, 99(1), 103-110. https://doi.org/10.1111/cbdd.13932
47. S. Tsukamoto, R. Yamanokuchi, M. Yoshitomi, K. Sato, T. Ikeda, H. Rotinsulu, R.E.P. Mangindaan, N.J. de Voogd, R.W.M. van Soest, H. Yokosawa, Aaptamine, an alkaloid from the sponge Aaptos suberitoides, functions as a proteasome inhibitor, Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2010, 20, 3341-3343.
48. N.K. Utkina, E.L. Chaikina, M.M. Anisimov, Influence of aaptamine alkaloids on the growth of seedling roots of agricultural plants, Natural Product Communications, 2017, 12, 1934578X1701200913.
49. H.-B. Yu, F. Yang, F. Sun, J. Li, W.-H. Jiao, J.-H. Gan, W.-Z.