Các hợp chất apptamine alkaloid phân lập được từ giống hải miên Aaptos, bên cạnh sự đặc biệt về cấu trúc hóa học còn thể hiện giá trị về hoạt tính sinh học như: kháng virut, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa, chống kí sinh trùng, và nôi bật nhất là hoạt tính tính gây độc tế bào ung thư.
Hợp chất điển hình aaptamine (A1) đã được nghiên cứu sâu về tác dụng và cơ chế gây độc tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau [45], [46]. Chẳng hạn, năm 2010, Tsukamoto và cộng sự cho thấy hợp chất này có tác dụng gây độc tế bào trên dòng HeLa với giá trị IC50 là 15 μg/mL [47]. Sau đó, năm 2011, Jin và cộng sự cũng phát hiện aaptamine có khả năng ngăn ngừa tăng sinh tế bào đối với
bệnh bạch cầu mãn tính dòng tủy (CML) K562. Aaptamine ức chế sự phát triển của K562 với nồng độ 50% sự phát triển của tế bào (GI50) là 10 μM và bắt giữ chu kì tế bào ở pha G2/M. Trong thí nghiệm Western blot chỉ ra rằng aaptamine gây ra biểu hiện p21 trong tế bào K562 [39]. Năm 2015, nghiên cứu của Gan và cộng sự đã chỉ ra hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào K562, MCF-7 và U937 với giá trị IC50 lần lượt là 3,84, 3,13 và 1,62 µM [33]. Ngoài ra, Zalilawati và cộng sự cho thấy hợp chất aaptamine thể hiện hoạt tính chống virus tốt trên HSV-1
[43]. Hơn nữa, aaptamine còn thể hiện hoạt tính kích thích trên rễ của cây con đậu nành, ngô, lúa mì và kiều mạch ở một loạt các nồng độ [48]. Hai hợp chất aaptamine (A1) và demethylaaptamine (A2) được đánh giá về khả năng gây độc của dòng tế bào ung thư máu L5178Y ở chuột, kết quả cho thấy giá trị IC50 lần lượt là 8.3 và 0.9 µM. Nghiên cứu này gợi ý rằng: hydroxy ở C-13 làm mất tính thơm ở vòng C, làm giảm tác dụng gây độc tế bào [41]. Hợp chất A2 cũng cho thấy tác dụng gây độc tế bào trên dòng HeLa với giá trị IC50 là 1,4 μg/mL [47]. Ngoài ra, hợp chất A2 kích thích sự phát triển rễ của đậu nành và ngô trong khoảng nồng độ 0,001-10 µg/mL [48].
Hợp chất demethyloxyaaptamine (A3) cũng được đánh giá tác dụng gây độc tế bào HeLa cho kết quả ED50 là 0.87 μg/mL [30]. Ở nghiên cứu của Gan và cộng sự, hợp chất A3 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa, K562, MCF-7 và U937 với giá trị IC50 trong khoảng 0,90-6,9 µM [33]. Khi nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn, hợp chất A3 được chứng minh là có tác dụng kháng vi khuẩn
như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris [30]. Ngoài ra, trên chủng M. smegmati hợp chất A3 cũng thể hiện hoạt tính chống vi khuẩn một cách chọn lọc với giá trị MIC là 6,25 µg /mL [39]. Ở nồng độ 2 μg/mL, hợp chất A3 cho thấy có tác dụng kháng virut (HSV-1) đồng thời thể hiện độc tính thấp đối với các tế bào thường Vero. Kết quả trên cho thấy hợp chất này có thể ức chế chọn lọc đối với sự nhân bản của virus [35]. Hợp chất 3-(methylamino)demethyl(oxy)aaptamine (A6) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa và K562 với giá trị IC50 lần lượt là 7,35 và 1,7 µM [33]. Hợp chất này được chứng minh khả năng chống vi khuẩn một cách chọn lọc với giá trị MIC là 6,25 µg/mL trên chủng M. smegmati [39]. Hợp chất isoaaptamine (A9) có tác dụng gây độc tế bào trên dòng HeLa với giá trị
IC50 3,1 μg/mL [47]. Hợp chất 9-amino-2-ethoxy-8-methoxy-3H-
24
benzo[de][1,6]naphthyridin-3-one (A13) thể hiện độc tính tế bào đối với các tế bào HL60, K562, MCF-7, KB, HepG2 và HT-29 với giá trị IC50 trong khoảng 0,11-6,6 µM [38]. Hai hợp chất aaptanone (A14) và N-demethylaaptanone (A15) được đánh giá tác dụng kích thích sinh trưởng cây nông nghiệp. Kết quả cho thấy, aaptanone (A15) kích thích rễ lúa mạch ở nồng độ 0,1 µg/mL. So sánh với các hợp chất cũng có khả năng kích thích sinh trưởng cây nông nghiệp (hợp chất A1 và A2) gợi ý rằng, sự có mặt của nhóm carbonyl trong hợp chất (A14) và (A15) làm giảm kích thích tăng trưởng [48]. Hợp chất 2,3-dihydro-2,3-dioxoaaptamine (A16) cũng thể hiện hoạt tính chống vi khuẩn một cách chọn lọc với giá trị MIC là 1,5 µg/mL trên chủng M. smegmati [39]. Hợp chất methylenedioxyaaptamine (A20) là hợp chất lần đầu tiênphân lập tự nhiên và nó thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ATL với IC50 là 0,29 µM [40]. Khi được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu, cả hai hợp chất 3-(phenethylamino)demethyl(oxy)aaptamine (A21), 3- (isopentylamino)demethyl(oxy)aaptamine (A22) đều thể hiện hoạt tính mạnh. Các nghiên cứu về SAR gợi ý rằng, sự hydroxy hóa ở C-9 và các nhóm thế phenyl được thay thế bằng một hoặc cả hai nitơ là yếu tố quan trọng tăng cường hoạt tính hay sự thay thế C-3 cũng có thể cũng ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào của nhóm hợp chất này [42]. Hợp chất A21 cũng làm giảm mạnh khả năng phát triển của HL-60 và thể hiện độc tính tế bào chống lại WEHI-3B thông qua quá trình apoptosis giống như hợp chất aaptamine [43]. Năm 2014, Yu và cộng sự cho thấy hợp chất A21, A22 thể hiện độc tính tế bào đối với các tế bào HL60, K562, MCF-7, KB, HepG2 và HT-29 với giá trị IC50 trong khoảng 0,03-8,5 µM. Đối với hai dòng tế bào HL60 và K562, hợp chất A21 và A22 thể hiện độc tính tế bào rất mạnh với IC50 nhỏ hơn 0,1 µM [38]. Sau đó, năm 2015, Gan và cộng sự nghiên cứu thêm về hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa, K562 của hợp chất A21. Kết quả cho thấy giá trị IC50 đối với hai dòng tế bào HeLa và K562 lần lượt là 7,35 và 1,7 µM [33]. Ngoài ra, ở nồng độ 10 µM, hợp chất A21 và A22 thể hiện hoạt tính chống HIV-1 với phần trăm ức chế lần lượt là 88,0% và 72,3% [38, 49]. Hợp chất 3-aminodemethyl(oxy) aaptamine (A23) thể hiện hoạt tính chống vi khuẩn một cách chọn lọc với giá trị MIC là 1,5 µg/mL trên chủng M. smegmati [39]. Các hợp chất A3, A8, A29-A32 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào P388,
HeLa và K562. Trên dòng tế bào P388, hợp chất suberitine B (A30) và D (A32), với một nhóm carbonyl ở C-9 hoặc C-9′, cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với các monome (A3) và (A8) với các giá trị IC50 lần lượt là 3,5 và 1,8 µM, trong khi suberitine A và C là không hoạt động đối với cùng một dòng tế bào tương tự [44]. Hợp chất 10-methoxy-2-methylimidazo[4,5,1-ij]pyrido[2,3,4-de]quinolone
A42 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa và K562 với giá trị
IC50 lần lượt là 10,63-12,32 µM [33].
26
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Loài hải miên Rhabdastrella globostellata (Carter, 1883)
Mẫu hải miên R. globostella (Carter, 1883) được thu ở vịnh Vân Phong, Nha Trang vào tháng 5 năm 2020. Tên khoa học của mẫu được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử bởi TS. Trần Mỹ Linh, phòng Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam (VAST). Mẫu tiêu bản (NCCT-B139) được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, VAST.
Hình 2.1. Hình ảnh mẫu hải miên R. globostellata thu tại vịnh Vân Phong
2.1.2. Loài hải miên Aaptos aaptos (Schmidt, 1864)
Mẫu hải miên A. aaptos (Schmidt, 1864) được thu ở vịnh Vân Phong, Nha Trang vào tháng 5 năm 2020. Tên khoa học của mẫu được xác định bởi GS.TS. Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam (VAST). Mẫu tiêu bản (NCCT-70) được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, VAST.
Hình 2.2. Hình ảnh mẫu hải miên A. aaptos thu tại vịnh Vân Phong
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng thuốc thử Dragendorff hay bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
- Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel và pha đảo RP-18. Silica gel có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Pha đảo RP-18 (150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đôi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
- Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế (HPLC) được thực hiện trên máy
AGILENT 1100, phòng Nghiên cứu cấu trúc, viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH và CN VN. Tốc độ dòng 3ml/phút, sử dụng 4 bước sóng 205, 230, 254 và 280 nm để phát hiện chất.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phô hiện đại bao gồm:
- Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS
Phô khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy AGILENT 6530 Accurate Mass QTOF LC/MS của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phô NMR đo trên máy: Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
+ Phô cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13
C NMR và DEPT.
+ Phô cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.
28
+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi CD3OD, CDCl3 và DMSO_d6. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo và không che khuất các tín hiệu phân tích.
- Phổ lưỡng sắc tròn (CD)
Phô CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.
-Phương pháp tính toán lý thuyết phổ ECD
Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên phần mềm Spartan 18 (Viện Hóa sinh biển). Mỗi phân tử được thực hiện theo phương pháp cơ học lượng tử MMFF (Merck molecular force field) và bán lượng tử PM3. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa và tính toán phô ECD theo hàm mật độ phụ thuộc thời gian (Time Dependent Density Functional Theory, TDDFT) trên phần mềm Gaussian 16 (Viện Hóa sinh biển) sử dụng các mức tính toán B3LYP/6- 31G(d,p), CAM-B3LYP/6-31G(d,p), hoặc wB97XD/6-31G(d,p). Ảnh hưởng của dung môi methanol được tính toán theo mô hình IEFPCM (Integral Eequation Formalism Polarizable Continuum Model). Các phô ECD thu được của mỗi cấu dạng sẽ được tông hợp lại dựa trên hệ số phân bố Boltzmann của chúng sử dụng mềm SpecDis v1.71 để nhận phô ECD theo lý thuyết của mỗi hợp chất.
- Phương pháp tính toán khoảng cách giữa hai proton
Các cấu dạng được tìm kiếm trên phần mềm Spartan 18. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa năng lượng và tính toán khoảng cách giữa các proton trên phần mềm Gaussian 16.
- Phương pháp tính toán lý thuyết 13C-NMR
Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên phần mềm Spartan 18. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa và tính toán NMR bằng phương pháp GIAO 13C NMR sử dụng phần mềm Gaussian 16 với mức tính toán wB97XD/6-31G(d). Các số liệu NMR thu được của mỗi cấu dạng sẽ được tông hợp lại dựa trên hệ số phân bố Boltzmann của chúng để nhận được số liệu NMR tính toán cho mỗi hợp chất. Cuối cùng, dữ liệu NMR tính toán sẽ được so sánh với dữ liệu NMR thực nghiệm bằng mô hình tính toán STS (Sorted Training Sets) [50].
- Độ quay cực [ ]D:
Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào ung thư ở người bao gồm ung thư gan (HepG2), ung thư phôi (LU-1), ung thư vú (MCF7) và ung thư da (SKMel2) tại Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác
nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan [51](1990). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tông số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
+Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
+ Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.
+ Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ,
được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 o
C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
+10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).
+ Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương;
- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm.
-Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
- Các dòng tế bào do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và
GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên R. globostellata
Mẫu hải miên R. globostellata (40 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối, ngâm chiết siêu âm với MeOH (3 lần
50 lít, mỗi lần 2h), sau khi thu được dịch chiết cất loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được 420 g cặn MeOH. Sau đó, cặn này được bô sung thêm 3 lít nước và chiết phân lớp bằng dung môi dichloromethane (2 lần
3 lít), dịch chiết dichloromethane được cất quay để loại bỏ dung môi thu được cặn chiết dichloromethane (320,0 g) và dịch nước.
Cặn chiết dichloromethane được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi độ phân cực tăng dần dichloromethane/methanol (1:0 → 0:1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn RD1 (20,0 g), RD2 (200,0 g), RD3 (60,0 g) và RD4 (35,0 g). Phân đoạn RD2 tiếp tục được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan/acetone (0-100%, tăng dần acetone) thu được 4 phân đoạn RD2A-RD2D. Phân đoạn RD2B được phân tách bằng cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi acetone/nước (2/1, v/v) thu được 5 phân đoạn, RD2B1–RD2B5. Sau đó, phân đoạn RD2B2 được tinh chế trên cột HPLC điều chế (J’sphere ODS H-