A. aaptos
3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ loài A aaptos
3.2.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài A. aaptos
3.2.1.1. Hợp chất AA1: 9-methoxy-N-demethylaaptanone (hợp chất mới)
Hình 3.78. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA1, hợp chất N-demethylaaptanone và các tương tác HMBC chính của hợp chất AA1
Hợp chất AA1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt. Khảo sát trên bản mỏng TLC nhận thấy hợp chất AA1 phản ứng dương tính với dung dịch của Dragendorff, gợi ý hợp chất AA1 là một hợp chất alkaloid. Trên phô khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất AA1 xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z 259,0710 [M+H]+, cho phép xác định cấu trúc của hợp chất này là C13H10N2O4 (tính toán lý thuyết cho công thức C13H11N2O4: 259,0713). Từ đó, tính được độ bất bão hòa của
100 hợp chất AA1 là DBE = 10. Phô 1
H NMR của hợp chất AA1 xuất hiện hai tín hiệu proton doublet có tương tác spin với nhau tại δH 8,79 (d, J = 5,0 Hz) và 7,16 (d, J = 5,0 Hz), một tín hiệu proton singlet tại δH 8,34. Bên cạnh đó là tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δH 4,14 (s) và 4,27 (s). Các tín hiệu proton tại δH 8,79 và 7,16 cũng như giá trị hằng số spin coupling J = 5,0 Hz cho thấy hợp chất này thuộc nhóm chất aaptamine alkaloid đã được tìm thấy từ các loài Aaptos ở Việt Nam cũng như trên thế giới [27, 28, 48, 56]. Phân tích phô 13
C NMR của hợp chất AA1 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 13 nguyên tử carbon. Trong đó, có 8 carbon không liên kết với hydro tại δC 114,8, 124,4, 142,0, 142,5, 154,1, 152,8, 159,2 và 176,7; ba carbon methine tại δC 107,4, 117,6 và 152,8 và hai nhóm methoxy tại δC 57,4 và 62,9. Theo tông quan tài liệu về giống Aaptos ở trên, so sánh dữ liệu phô 1H-và 13
C NMR của hợp chất AA1 với hợp chất N-demethylaaptanone [28] cho thấy, số liệu phô của hai hợp chất này tương đối phù hợp. Tuy nhiên điểm khác biệt dễ nhận thấy đó là hợp chất N-demethylaaptanone chỉ có một nhóm methoxy, trong khi đó hợp chất AA1 được phân tích là có hai nhóm methoxy. Như vậy có thể dự đoán hợp chất
AA1 có cấu trúc tương tự như hợp chất N-demethylaaptanone nhưng có hai nhóm
methoxy. Trên phô HMBC cho thấy tương tác giữa proton tại δH 8,79 và C-3 (δC 107,4), C-3a (δC142,0), C-9a (δC 142,5); giữa proton tại δH 7,16 và C-2 (δC 152,8), C-3a (δC142,0), C-9b (δC 114,8) cho phép gán các vị trí C-2, C-3, C-3a, C-9a và C- 9b tạo nên nhân 1,6-naphthyridine tương tự hợp chất N-demethylaaptanone. Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa proton tại δH 8,34 và C-6 (δC 176,7), C-6a (δC 124,4), C-9b (δC 114,8), C-8 (δC 154,1), C-9 (δC 152,8) cho thấy nhóm ketone tại C- 6, xác định cấu tạo vòng còn lại gắn với nhân 1,6-naphthyridine tại C-6a và C-9a. Vị trí của hai nhóm methoxy được xác định tại C-8 và C-9 bởi tương tác HMBC giữa proton tại δH 4,27 và C-8 (δC 154,1), giữa proton tại δH 4,14 và C-9 (δC 152,8). Để khẳng định rõ hơn về sự có mặt của 1 nhóm NH trong phân tử (tại vị trí số 4), hợp chất AA1 tiếp tục được phân tích phô 1
H NMR trong dung môi DMSO-d6 và xác nhận với sự xuất hiện thêm một tín hiệu proton của nhóm NH tại δH 12,06. Từ những dữ kiện phô và phân tích nêu trên, hợp chất AA1 được xác định là 8,9- dimethoxy-4H-benzo[de][1,6]-naphthyridine-5,6-dione. Tra cứu cấu trúc này trên
cơ sở dữ liệu Scifinder cho thấy, AA1 là hợp chất mới, có cấu trúc là 9-methoxy-N- demethylaaptanone.
Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA1 và hợp chất tham khảo
C 2 3 3a 5 6 6a 7 8 9 9a 9b 8-OCH3 9-OCH3 a)
đo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz, #δC của hợp chất N- demethylaaptanone đo trong dung môi CF3COOD [28]
Hình 3.79. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AA1
102
Hình 3.80. Phổ 1H NMR của hợp chất AA1 đo trong dung môi CD3OD
Hình 3.81. Phổ 1H NMR của hợp chất AA1 đo trong dung môi DMSO-d6
Hình 3.82. Phổ 13C NMR của hợp chất AA1
Hình 3.83. Phổ HSQC của hợp chất AA1
104
Hình 3.84. Phổ HMBC của hợp chất AA1
3.2.1.2. Hợp chất AA2: 3,5-dicarbomethoxy-1,6-naphthyridine (hợp chất mới)
Hình 3.85. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AA2
Hợp chất AA2 phân lập được ở dạng chất rắn vô định hình, màu nâu nhạt. Tương tự như hợp chất AA1, hợp chất này là một alkaloid, có phản ứng dương tính với dung dịch của Dragendorff. Trên phô HR-ESI-MS của AA2 xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z 247,0711 [M+H]+ cho phép xác định công thức phân tử hợp chất này là C12H10N2O4 (tính toán lý thuyết cho công thức C12H11N2O4: 247,0719). Trên phô 1
H NMR của hợp chất AA2 xuất hiện tín hiệu của hai cặp proton olefin tại δH 8,83, 8,20 (J = 5,5 Hz) và δH 9,28, 7,99 (J = 4,5 Hz), các tín hiệu này đặc trưng cho TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
nhân 1,6-naphthyridine ở các aaptamine alkaloid [28, 34]; hai tín hiệu singlet của 2 nhóm methoxy tại δH 4,01 (6H). Phô 13C NMR và HSQC của hợp chất AA2 cũng
cho thấy 8 tín hiệu carbon của khung 1,6-naphthyridine bao gồm bốn carbon methine thơm tại δC 156,9, 146,3, 126,0 và 125,0 và 4 carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 152,7, 152,2, 139,3 và 118,5. Ngoài ra, hai nhóm carboxylate tại δC 167,9 x 2 và hai nhóm methoxy tại δC 53,7 và 53,6. Từ những phân tích trên gợi ý hợp chất AA2 là dẫn xuất của 1,6-naphthyridine dicarboxylic. Bên cạnh đó, tương tác HMBC từ H-2 (δH 8,83) đến C-3 (δC 126,0)/C-3a (δC 152,2)/C-9a (δC 152,7), từ H-3 (δH 8,20) đến C-2 (δC 146,3)/C-9b (δC 118,5), từ H-5 (δH 9,28) đến C- 3a (δC 152,2)/C-6 (δC 125,0)/C-6a (δC 139,3), từ H-6 (δH 7,99) đến C-5 (δC 156,9)/C-9b (δC 118,5)/carboxyl (δC 167,9) xác định cấu trúc của khung aaptamine. Hai nhóm methoxy còn lại được chứng minh nằm tại C-7 và C-9 bởi tương tác HMBC giữa (δH 4,01) và C-7(δC 167,9)/C-9 (δC 167,9). Từ những bằng chứng trên, hợp chất AA2 được xác định là 3,5-dicarbomethoxy-1,6-naphthyridine và đây là một hợp chất mới.
Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA2
C 2 3 3a 5 6 6a 7 8 9 9a 10
a)đo trong CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz, *tín hiệu có thể đổi chỗ cho nhau
106
Hình 3.86. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AA2
Hình 3.87. Phổ 1H NMR của hợp chất AA2
Hình 3.88. Phổ 13C NMR của hợp chất AA2
Hình 3.89. Phổ HSQC của hợp chất AA2
108
Hình 3.90. Phổ HMBC của hợp chất
AA2 3.2.1.3. Hợp chất AA3: aaptosvanphong A (hợp chất mới)
Hình 3.91. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AA3
Hợp chất AA3 thu được dưới dạng chất rắn có màu nâu nhạt. Công thức phân tử của hợp chất AA3 được xác định là C15H14N2O4 dựa trên kết quả phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, với việc xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z
287,1032 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C15H15N2O4: 287,1026) với độ bất bão hòa của phân tử là DBE=10. Phô 1
H NMR xuất hiện bốn tín hiệu proton olefin [thuộc hai cặp proton có tương tác với nhau tại δH 8,74 (d, J = 6,0 Hz)/7,93 (d, J = 6,0) và δH 9,15 (d, J = 4,5 Hz)/7,56 (d, J = 4,5 Hz)]; 1 proton methine tại δH
109
hiện của 2 cặp proton olefin và giá trị hằng số tương tác spin của chúng cho thấy sự có mặt của nhân 1,6-naphthyridine ở các aaptamine alkaloid giống như hợp chất
AA1-AA2 [28, 34]. Sự có mặt của hai vòng thuộc hợp chất aaptamine còn được
khẳng định bởi tám tín hiệu carbon trên phô 13
C-NMR, trong đó có bốn carbon methine thơm tại δC 121,8, 123,5, 146,0 và 155,6 có tương tác HSQC với các proton lần lượt tại δH 7,93, 7,56, 8,74 và 9,15, còn lại là 4 carbon không liên kết với hydro tại δC 115,9, 140,6, 150,8 và 159,6. Hơn nữa, các tương tác HMBC giữa δH 8,74 và
δC 121,8, 150,8, 159,6, giữa δH 7,93 và δC 115,9 và 146,0 cho phép quy kết vị trí C- 2, C-3, C-3a, C-9a và C-9b, δH 9,15 và δC 123,5, 140,6, 150,8, giữa δH 7,56 và δC 115,9, 140,6 và 155,6 cho phép quy kết các vị trí của vòng còn lại trong cấu trúc 1,6-naphthyridine là C-4, C-5 và C-9b. Ngoài ra, phô 13
C NMR của hợp chất AA3 còn cho thấy sự có mặt của ba carbon không liên kết với hydro tại δC 77,0, 105,0 và 110,6, một carbon methin tại δC 70,6, một carbon CH2 tại δC 55,7, 1 nhóm methyl tại δC 19,3 và 1 nhóm methoxy tại δC 54,6.
Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA3
C 2 3 3a 5 6 6a 7 8 9 9a 9b 10 11 12 8-OCH a)đo trong CDCl3, b)125 MHz, c)500 MHz
Từ những phân tích trên gợi ý cấu trúc hóa học của hợp chất AA3 có thêm một vòng sáu cạnh nối với hai vòng của aaptamine tại C-6a, C-9a, C-9b theo như
quá trình sinh tông hợp các hợp chất aaptamine phô biến trong các loài Aaptos [57]. Điều này cũng được minh chứng bởi các tương tác quan sát trên phô HMBC giữa H-7 (δH 5,00) với C-6 (δC 140,6)/C-9b (δC 115,9)/C-8 (δC 110,6) và C-9 (δC 77,0). Tương tác HMBC giữa proton methoxy (δH 3,75) với C-8 (δC 110,6) đã cho thấy sự có mặt của một nhóm methoxy tại C-8. Tương tác HMBC giữa H-10 (δH 2,47/2,33) với C-9a (δC 159,6), C-8 (δC 110,6), C-9 (δC 77,0) và C-11(δC 105,0), H3-12 (δH 1,69) và C-11 (δC 105,0), C-10 (δC 55,4) cho phép quy kết mảnh cấu trúc liên kết tại C-9. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-8 (δC 110,6) và C-11 (δC 105,0) cho thấy chúng là các deoxygenated carbon từ đó gợi ý cho sự hình thành thêm vòng năm cạnh giữa C-8 và C-11 thông qua cầu oxygen. Bên cạnh đó, giá trị độ bất bão hòa của AA3 là 10, CTPT C15H14N2O4, chứng tỏ phải tồn tại thêm một vòng nữa trong cấu trúc của hợp chất này, từ đó gợi ý cho sự hình thành cầu nối qua nguyên tử oxygene giữa C-7 và C-9. Hơn nữa, các tương tác HMBC giữa H-7 δH 5,00 với với C-8 (δC 110,6), C-9 (δC 77,0), giữa H-10 (δH 2,47/2,33) với C-9a (δC 159,6), C-8 (δC 110,6), C-9 (δC 77,0) và C-11(δC 105,0) đã khẳng định thêm các dự đoán về cấu trúc nêu trên. Như vậy trong phân tử AA3 chỉ còn một nhóm hydroxy tự do. Để khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxy tự do này, hợp chất AA3 được phân tích thêm phô 1
H NMR trong dung môi DMSO-d6. Trên phô 1
H NMR (DMSO-d6) chỉ xuất hiện thêm duy nhất 1 píc của một proton OH tại δH 6,61 (br s) chứng tỏ cho sự hiện diện của chỉ một nhóm hydroxy trong cấu trúc của AA3.
Trên phô NOESY xuất hiện tương tác giữa H-7 (δH 5,00) và nhóm methoxy (δH 3,75) chứng tỏ H-7 nằm cùng phía với nhóm methoxy trong phân tử (giả thiết có cấu hình β), do đó cầu oxygen giữa C-7 và C-9 sẽ có định hướng không gian ở phía còn lại (cấu hình α). Từ những bằng chứng nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất
AA3 đã được làm sáng tỏ. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là aaptos
vanphong A. Tuy vậy, do C-11 và C-8 là các carbon không liên kết trực tiếp với hydro, trên phô NOESY không quan sát được các tín hiệu NOESY cần thiết tương tác với nhóm methyl H3-12 (δH 1,69), do đó hóa lập thể tại C-11 vẫn chưa xác định được.
111
Hình 3.92. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AA3
Hình 3.93. Phổ 1H NMR của hợp chất AA3 đo trong dung môi CDCl3
Hình 3.94. Phổ 1H NMR của hợp chất AA3 đo trong dung môi DMSO-d6
Hình 3.95. Phổ 13C NMR của hợp chất AA3
113
Hình 3.96. Phổ HSQC của hợp chất AA3
Hình 3.97. Phổ HMBC của hợp chất AA3
Hình 3.98. Phổ COSY của hợp chất AA3
Hình 3.99. Phổ NOESY của hợp chất AA3
115
3.2.1.4. Hợp chất AA4: aaptosvanphong B (hợp chất mới)
Hình 3.100. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất AA4
Hợp chất AA4 có công thức phân tử là C16H11N3O2 được xác định nhờ kết quả phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z
278,0919 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C16H12N3O2: 278,0924). Từ đó tính được độ bất bão hòa bằng 13. Phô 1H NMR của hợp chất AA4 xuất hiện các píc sau: hai cặp proton olefin dạng douplet có cùng giá trị hằng số J = 5 Hz tại δH 8,52, 7,54, 8,70 và 7,43; một cặp hai tín hiệu proton olefin dạng doublet khác có giá trị hằng số J = 2,5 Hz tại δH 7,15 và 6,54; một tín hiệu singlet của một proton olefin tại δH 7,71 và một nhóm methoxy tại δH 3,96 (s). Các tín hiệu phô trên cho thấy hợp chất AA4
cũng có nhân 1,6-naphthyridine tương tự hợp chất AA2 và AA3.
Phô 13C NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 16 nguyên tử carbon, phù hợp với kết quả của phô khối lượng, trong đó bao gồm: Trong đó, có
8 carbon không liên kết với hydro tại δC 122,9, 125,7, 128,9, 137,3, 142,4, 151,0, 155,7, và 172,5; 7 carbon methine tại δC 114,0, 120,0, 121,8, 125,3, 137,3, 146,9 và 153,0; 1 nhóm methoxy tại δC 52,3. Dựa vào phô HSQC, các proton gắn trực tiếp vào từng carbon được xác định (Bảng 3.16). Trên phô HMBC cho thấy tương tác giữa proton tại δH 8,52 và δC (120,0, 151,0, 155,7); giữa proton tại δH 7,54 và δC (125,7 và 146,9); giữa proton tại δH 8,70 và carbon tại δC (121,8, 142,4, 155,7); giữa proton tại δH 7,43 và carbon tại δC 125,7 cho phép gán 8 vị trí của 2 vòng 1,6- naphthyridine (C-2, C-3, C-3a, C-9a, C-9b, C-5, C-6, C-6a). Kết quả này đã khẳng định lại sự có mặt của nhân 1,6-naphthyridine trong hợp chất aaptamine alkaloid cũng như cho phép quy kết chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học proton và
carbon thuộc mảnh cấu trúc này (C-2, C-3, C-3a, C-9a, C-9b, C-5, C-6 và C-6a). Ngoài ra, trên phô HMBC còn quan sát thấy các tương tác từ H-8 (δH 7,71) đến C- 6a (δC 142,4)/C-7 (δC 128,9)/C-9a (δC 137,3)/C-10 (δC 114,0) và carbonyl tại δC 172,5, từ H-11 (δH 7,15) đến C-9a (δC 137,3)/C-9 (δC 122,9)/C-10 (δC 114,0), từ H-
10(δH 6,54) đến C-8 (δC 137,3)/C-9 (δC 122,9)/C-9a (δC 137,3)/C-11 (δC 125,3) và từ H-6 (δH 7,43) đến C-7 (δC 128,9). Tô hợp các tương tác trên gợi ý sự hiện diện của một vòng bảy cạnh và một vòng pyrrole gắn với khung 1,6-naphthyridine tại C- 6a và C-9b. Sự có mặt của một nhóm CH3OCO- được xác định bởi tương tác
HMBC giữa proton methoxy tại 3,96 với C=O tại 172,5, đồng thời nhóm CH3OCO- nối vào vị trí C-8 đã được chứng minh bởi tín hiệu singlet của H-7 tại δH 7,71 và trên phô HMBC cũng cho thấy tương tác từ H-7 (δH 7,71) với C=O tại 172,5. Theo công thức phân tử đã được xác định, cùng với việc phân tích cấu trúc các mảnh cấu trúc nêu trên cho thấy phân tử của hợp chất này còn một nhóm NH. Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa H-11 (δH 7,15) và C-9a (δC 137,3) đã minh chứng cho cầu nối giữa C-11 và C-9a thông qua nhóm NH. Như vậy, cấu trúc của hợp chất AA4
được làm sáng tỏ. Đây là một aaptamine mới và được đặt tên là aaptosvanphong B.
Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA4
C 2 3 3a 5 6 6a 7 8 9 9a 9b 9c 10 11 13 OMe a)
đo trong CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz
117
Hình 3.101. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AA4
Hình 3.102. Phổ 1H NMR của hợp chất AA4
Hình 3.103. Phổ 13C NMR của hợp chất AA4
Hình 3.104. Phổ HSQC của hợp chất AA4
119
Hình 3.105. Phổ HMBC của hợp chất
AA4 3.2.1.5. Hợp chất AA5: 2-methoxy-3-oxoaaptamine
Hình 3.106. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AA5
Hợp chất AA5 có công thức phân tử là C14H12N2O4 được xác định bởi kết quả phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z 273,0863 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C14H13N2O4: 273,0875). Phô 1
H NMR xuất hiện tín hiệu của một cặp proton doublet tại δH 8,79 (d, J = 5,0 Hz) và 8,04 (d, J = 5,0 Hz), một tín hiệu singlet tại δH 7,33 (s) cho thấy proton này đứng biệt lập và không có các proton khác ở bên cạnh. Ngoài ra, trên phô còn có ba tín hiệu singlet của ba nhóm methoxy tại δH 4,07, 4,13 và 4,51.
Phô 13
C NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 14 nguyên tử carbon tại δC 173,5, 158,6, 157,4, 151,2, 146,7, 144,6, 136,3, 126,4, 126,3, 120,8,