A. aaptos
3.1.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài R globostellata
3.1.1.1. Hợp chất RG1: rhabdaglostelone A (hợp chất mới)
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất RG1
Hợp chất RG1 thu được dưới dạng gel màu vàng. Trên phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất RG1 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 479,2795 [M+H]+ (phô (+) HR-ESI-MS) và m/z 477,2644 [M-H]- (phô (-)-HR-ESI- MS), kết hợp với dữ kiện phô 13
C NMR cho phép xác định công thức phân tử C30H38O5 và độ bất bão hòa bằng 12. Trên phô 1
H NMR của hợp chất RG1 xuất hiện tín hiệu của bảy nhóm methyl bậc ba dạng singlet tại δH 0,81, 1,07, 1,16, 1,61, 1,82, 2,05 và 2,06 (3H, s); ba tín hiệu proton olefin tại δH 5,88 (d, J = 10,5 Hz), 6,39 (d, J = 7,0 Hz) và 7,34 (d, J = 7,0 Hz). Phân tích phô 13
C NMR và phô HSQC thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 nguyên tử carbon trong đó có 3 carbon C=O tại δC 164,9, 212,2 và 222,3; 9 tín hiệu carbon không liên kết với hydro tại δC 37,3, 45,1, 48,1, 85,8, 125,1, 129,7, 131,3, 159,7 và 186,1; 6 tín hiệu carbon methine tại
δC 46,8, 54,7, 63,8, 103,8, 127,6 và 142,2; 5 tín hiệu carbon methylene tại δC 20,1, 31,5, 33,1, 33,8 và 34,5; 7 tín hiệu của nhóm methyl tại δC 8,9, 13,1, 16,4, 19,8, 23,4, 23,6 và 29,4. Từ những phân tích dữ liệu phô ở trên cho thấy hợp chất RG1 là một triterpene có 3 nhóm C=O, 4 nối đôi và 5 vòng. Ngoài ra, các
43
proton cạnh nhau tương tác trên phô COSY, bao gồm H2-1 (δH 1,58 và 2,32)/H2-2 (δH 2,34 và 2,89) và H-5 (δH 2,57)/H2-6 (δH 1,66 và 1,70)/ H2-7 (δH 1,99 và 2,35); tương tác HMBC giữa H3-19 (δH 0,81) và C-1 (δC 33,1)/C-5 (δC 46,8)/C-9 (δC 54,7)/C-10 (δC 37,3), H2-2 (δH 2,34 và 2,89) và C-3 (δC 222,3), H3-28 (δH 1,16)/H3-
29(δH 1,07) và C-3 (δC 222,3)/C-4 (δC 48,1)/C-5 (δC 46,8), cho phép xác định cấu trúc của hai vòng sáu cạnh (vòng A và B) và nhóm ketone nằm tại vị trí C-3. Hơn nữa, tương tác COSY của H-9 (δH 1,64)/H2-11 (δH 1,78 và 2,10), các tương tác HMBC giữa H-30 (δH 1,30) với C-8 (δC 43,8)/C-9 (δC 50,5)/C-13 (δC 145,1); giữa H-11 (δH 2,13 và 2,21) với C-8 (δC 43,8)/C-9 (δC 50,5)/C-12 (δC 206,5) khẳng định sự tồn tại vòng C của hệ thống 3 vòng ngưng tụ 6,6,5-tricyclic, một kiểu cấu trúc isomalarabaricane rất đặc trưng của giống Rhabdastrella. Tuy nhiên, các tín hiệu phô NMR của hợp chất RG1 còn cho thấy sự hiện diện thêm của 1 vòng năm cạnh nữa tạo nên hệ 6/6/5/5 tetracyclic. Điều đó được minh chứng bởi các tương tác HMBC giữa H-16 (δH 3,59) và C-12 (δC 85,8)/C-13 (δC 186,1)/C-15 (δC 212,1), H3- 18 (δH 1,82) và C-13 (δC 186,1)/C-14 (δC 129,7)/C-15 (δC 212,1). Hơn nữa, độ chuyển dịch hóa học carbon tại C-12 (δC 85,8), C-13 (δC 186,1), C-14 (δC 129,7) và C-15 (δC 212,1) chỉ ra rằng nhóm hydroxy tại C-12, liên kết đôi tại C-13/C-14 và 1 nhóm ketone khác tại C-15. Mảnh cấu trúc tiếp theo bao gồm 3 liên kết đôi tại C- 17/C-20, C-22/C-23 và C-24/C-25 được xác định dựa trên các tương tác COSY H- 16 (δH 3,59)/H-17 (5,88), tương tác HMBC giữa H3-21 (δH 2,06) và C-17 (δC 127,6)/C-20 (δC 131,3)/ C-22 (δC 159,7), giữa H-23 (δH 6,39) và C-20 (δC 131,3)/C-
22 (δC 159,7), tương tác COSY của H-23 (δH 6,39)/ H-24 (δH 7,34), tương tác HMBC giữa H3-27 (δH 2,05) và C-24 (δC 142,2)/C-25 (δC 125,1)/C-26 (δC 164,9). Ngoài 4 vòng hệ 6/6/5/5 tetracyclic đã được chứng minh ở trên, 1 vòng còn lại được xác định là do sự đóng vòng giữa C-22/C-26 tạo liên kết lacton giữa C-22 và C-26 bởi độ chuyển dịch hóa học carbon tại C-22 (δC 159,7) và C-26 (δC 164,9) và điều này phù hợp cho CTPT C30H38O5 của hợp chất. Hóa lập thể của 3 vòng tricyclic sắp xếp với nhau theo kiểu trans-syn-trans được làm sáng tỏ qua các tương tác trên phô NOESY. Tương tác NOESY giữa H3-19 (δH 0,81) và H3-29 (δH 1,07), giữa H-5 (2,57) và H3-28 (δH 1,16) chỉ ra rằng vòng A và B ở vị trí trans. Giả sử C-19 và C- 29 có cấu hình β thì C-28 và H-5 có cấu hình α.
Hình 3.2. Các tương tác NOESY của hợp chất RG1
Hình 3.3. Phổ ECD thực nghiệm của hợp chất RG1 và phổ ECD tính toán theo lý thuyết của đồng phân 5R,8S,9S,10R,12R,16R
Tương tác NOESY giữa H-5 (δH 2,57) và H3-30 (δH 1,61) cho thấy C-30 định hướng α giống H-5 nên vòng B và C là trans với nhau. Tương tác NOE giữa H-9 (δH 1,64) với H3-19 (δH 0,81) cho thấy H-9 và C-19 có vị trí tương đối syn với nhau. Tiếp tục phân tích các tương tác trên phô NOESY cho thấy, tương tác NOESY giữa H-9 (δH 1,64) và H-17 (δH 5,88) chỉ ra C-17 có cấu hình β (H-16 có cấu hình α). Việc xác định cấu hình của nhóm 12-OH dựa vào đồng thời kết quả tính toán lý thuyết về khoảng cách giữa H-9 và H-17 đối với hai cấu hình α/β-12-OH và kết quả thu được trên phô NOESY. Theo tính toán lý thuyết, đối với cấu hình 12-OH/α, khoảng cách giữa H-9 và H-17 là 2,502−2,609 Ao, còn đối với cấu hình cấu hình TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
45
12-OH/β thì khoảng cách này là 4,615−4,726 Ao. Chính vì vậy, việc xuất hiện tương tác NOESY giữa H-9 và H-17 chứng tỏ các proton này có khoảng cách gần nhau, phù hợp cho cấu hình 12-OH/α. Liên kết đôi tại C-17/C-20 được chứng minh có cấu hình E bởi tương tác NOESY giữa H-16 (δH 3,59) và H3-21 (δH 2,06). Cuối cùng, cấu hình tuyệt đối của hợp chất RG1 được xác định bằng cách so sánh phô ECD thực nghiệm của hợp chất này với phô ECD được tính toán theo TD-DFT đối với đồng phân 5R,8S,9S,10R,12R,16R. Trước tiên, phô ECD của đồng phân này lần lượt được tính toán theo hàm số B3LYP, CAM-B3LYP, và wB97XD là các hàm số thường sử dụng trong tính toán phô ECD của các hợp chất thiên nhiên. Sự tương đồng về chiều hướng các hiệu ứng Cotton trên phô ECD thực nghiệm so với tính toán lý thuyết cho phép xác định cấu hình tuyệt đối của RG1 là 5R,8S,9S,10R,12R,16R. Từ những phân tích trên, cấu trúc của hợp chất RG1 đã được xác định, đây là một hợp chất mới và được đặt tên là rhabdaglostelone A.
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG1 C δCa,b 1 33,1 2 34,5 3 222,3 4 48,1 5 46,8 6 20,1 7 33,8 8 45,1 9 54,7 10 37,3 11 31,4 12 85,8 13 186,1 14 129,7 15 212,1 a
Đo trong CD3OD,b125MHz, c500MHz.
Bảng 3.2. Khoảng cách giữa H-9 và H-17 cho các cấu dạng của hai hợp chất RG1a
(cấu hình 12α-OH) và RG1b (cấu hình 12β-OH, (H-9 và H-17 màu xanh)
Hình 3.4. Phổ (+)-HR-ESI-MS của hợp chất RG1
Hình 3.5. Phổ (-)-HR-ESI-MS của hợp chất RG1
48
Hình 3.6. Phổ 1H NMR của hợp chất RG1
Hình 3.7. Phổ 13C NMR của hợp chất RG1
Hình 3.8. Phổ HSQC của hợp chất RG1
Hình 3.9. Phổ HMBC của hợp chất RG1
50
Hình 3.10. Phổ COSY của hợp chất RG1
Hình 3.11. Phổ NOESY của hợp chất RG1
3.1.1.2. Hợp chất RG2: rhabdaglostelone B (hợp chất mới)
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất RG2
Hợp chất RG2 thu được dưới dạng gel màu vàng. CTPT của hợp chất RG2 được xác định giống với hợp chất RG1 là C30H38O5, dựa trên sự xuất hiện của píc ion giả phân tử tại m/z 479,2791 [M+H]+ và m/z 477,2641 [M-H]-. Tương tự hợp chất RG1, trên phô proton của hợp chất RG2 cũng xuất hiện tín hiệu của bảy nhóm methyl bậc ba dạng singlet tại δH 0,82, 1,04, 1,13, 1,60, 1,81, 1,94 và 2,09 (3H, s); ba tín hiệu proton olefin tại δH 6,17 (d, J = 7,0 Hz), 6,65 (d, J = 9,0 Hz) và 7,13 (d,
J= 7,0 Hz). Trên phô 13
C NMR của hợp chất RG2 cũng thấy xuất hiện tín hiệu của 30 carbon gần như giống với RG1. Ngoài ra, các tương tác HMBC và COSY của
RG2 và RG1 cũng nhận thấy tương tự nhau cho thấy hai hợp chất này là 1 cặp đồng phân lập thể. Trên phô NOESY của hợp chất RG2 cho thấy tín hiệu của H-5 (δH
2,47) và H3-28 (δH 1,13)/H3-30 (δH 1,60), H3-19 (δH 0,82) và H3-29 (δH 1,04) chỉ ra cấu hình trans cho 2 vòng A và B; H-5, C-29 và C-30 có cấu hình α; C-19 và C- 29có cấu hình β. Tương tác NOESY giữa H3-19 (δH 0,82) và H-9 (δH 1,63)/Hb-11 (δH 2,10), H-9 và Hb-11 chỉ ra cấu hình β cho H-9 và Hb-11. Nối đôi tại C-17/C-20 được xác định là cấu hình E bởi tương tác NOESY giữa H-16 (δH 3,21) và H3-21 (δH 1,94). Sự khác biệt đáng chú ý so với hợp chất RG1 là tương tác NOESY giữa H-9 (δH 1,63) và H-16 (δH 3,21) cho thấy H-16 có cấu hình β (hay C-17 có cấu hình α). Đồng thời, tương tác NOESY giữa H-9 và H-16 cũng chỉ ra cấu hình của nhóm OH tại C-12 là α bởi khoảng cách giữa H-9 và H-16 của đồng phân 12α-OH là (3,032−3,067 Ao) gần hơn so với đồng phân 12β-OH (4,504−4,511 Ao). Cấu hình TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
52
tuyệt đối của hợp chất RG2 được xác định là 5R,8S,9S,10R,12R,16S bằng cách so sánh phô ECD thực nghiệm của hợp chất này với phô ECD được tính toán TD-DFT của đồng phân 5R,8S,9S,10R,12R,16S. Như vậy, hợp chất RG2 được xác định là một hợp chất mới thuộc nhóm chất dẫn xuất của isomalabaricane và được đặt tên là rhabdaglostelone B.
Hình 3.13. Các tương tác NOESY của hợp chất
RG2 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG2 C δCa,b 1 32,0 2 33,5 3 219,1 4 46,9 5 45,6 6 19,2 7 32,7 8 43,8 9 52,8 10 36,0 11 33,5 12 84,5 13 182,6 14 128,8 15 207,5 a đo trong CDCl3,b 125MHz, c500MHz.
Bảng 3.4. Khoảng cách giữa H-9 và H-16 cho các cấu dạng của hai hợp chất RG2a (cấu hình 12α-OH) và RG2b (cấu hình 12β-OH, (H-9
và H-16 màu xanh) (Hệ số phân bố Boltzmann, %, Khoảng cách (A RG2a-1 (1,47%) RG2a-2 (1,47%) RG2a-3 (27,98%) RG2a-4 (1,47%) RG2a-5 (1,46%) RG2a-6 (1,47%)
Hình 3.14. Phổ ECD thực nghiệm của hợp chất RG2 và phổ ECD tính toán theo lý thuyết của dạng đồng phân (5R,8S,9S,10R,12R,16S)
Hình 3.15. Phổ (+)-HR-ESI-MS của hợp chất RG2
55
Hình 3.16. Phổ (-)-HR-ESI-MS của hợp chất RG2
Hình 3.17. Phổ 1H NMR của hợp chất RG2
Hình 3.18. Phổ 13C NMR của hợp chất RG2
Hình 3.19. Phổ HSQC của hợp chất RG2
57
Hình 3.20. Phổ HMBC của hợp chất RG2
Hình 3.21. Phổ COSY của hợp chất RG2
Hình 3.22. Phổ NOESY của hợp chất
RG2 3.1.1.3. Hợp chất RG3: rhabdaglostelone C (hợp chất mới)
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất RG3
Hợp chất RG3 phân lập được ở dạng gel màu vàng. Trên phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất này xuất hiện píc ion giả phân tử tại m/z 467,2797 [M+H]+ và m/z 501,2419 [M+Cl]- cho phép xác định CTPT của hợp chất
này là C29H38O5. Phân tích phô 1H và 13
C NMR của hợp chất RG3 nhận thấy khá tương đồng với số liệu phô của hợp chất RG1 và RG2. Tuy nhiên có một vài sự khác biệt: trên phô 1
H NMR của RG3 chỉ xuất hiện 1 tín hiệu proton của olefin δH
7,39 so với ở hợp chất RG1, RG2 có 3 proton olefin. Trên phô 13C NMR của RG3
xuất hiện tín hiệu của 29 carbon gợi ý rằng nó là một nortriterpene thay vì triterpene như RG1 và RG2. Dữ liệu phô 1H-,13C- NMR và các tương tác HSQC, HMBC của hợp chất RG3 cũng cho thấy sự hiện diện của hệ 6/6/5/5 tetracyclic giống với các hợp chất RG1 và RG2. Ngoài ra, các tín hiệu tương ứng C-16, C-17 và C-20 đến C- 27 có sự khác biệt rõ về giá trị độ chuyển dịch hóa học so với hợp chất RG1 và
RG2. Hơn nữa, tương tác HMBC giữa H-17 (δH 7,39) và C-16 (δC 67,6), giữa H3-21 (δH 1,88) và C-17 (δC 157,5)/C-20 (δC 144,0)/C-22 (δC 209,2) chứng minh rằng nối đôi tại C-17/C-20 và một nhóm ketone tại C-22. Tương tác HMBC giữa H-17 (δH
7,39)/C-23 (δC 47,2) và H-23 (δH 2,80)/C-12 (δC 88,2) cho thấy sự xuất hiện thêm 1 vòng năm cạnh so với RG1 và RG2, bởi sự đóng vòng qua liên kết trực tiếp giữa C- 16 và C-23. Còn lại 3 tín hiệu carbon [δC 30,2 (CH3), 42,9 (CH2), và 205,6 (C)] được quy kết cho nhóm 2-keto-propyl ở C-23. Điều này được xác nhận thêm bởi tương tác COSY giữa H-23 (δH 2,80)/H2-24 (δH 2,37 và 2,50) và tương tác HMBC giữa H3-27 (δH 2,07) và C-24 (δC 42,9)/C-25 (δC 205,6). Các tương tác NOESY hệ 6/6/5/5 tetracyclic của hợp chất này giống với hợp chất RG1. Hóa lập thể của hệ 6/6/5/5 tetracyclic của RG3 được xác định tương tự như RG1 và RG2 thông qua phô NOESY. Trong đó, tương tác NOESY giữa H-23 (δH 2,80) và H-9 (δH 2,00) cho thấy C-23 ở gần H-9 (hay cấu hình tương đối carbon spiro C-16 là 16R). Đồng thời, tương tác NOESY giữa H-23 và H-9 cũng cho phép xác định nhóm hydroxy tại C- 12 có cấu hình tương đối α như ở RG1 và RG2. Do tính dễ chuyển hóa giữa các cấu dạng ở vòng năm cạnh, các tín hiệu tương tác trên phô NOESY chưa đủ để kết luận về hóa lập thể tại vị trí C-23. Do vậy, tính toán lý thuyết phô 13C NMR theo phương pháp GIAO và mô hình tính toán STS (Sorted Training Sets) được sử dụng để xác định hóa lập thể C-23 [50]. Kết quả tính toán lý thuyết phô 13C NMR cho hai dạng đồng phân lập thể rel-(5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R) và rel- (5R,8S,9S,10R,12S,16R,23S) và áp dụng mô hình STS cho thấy các số liệu 13C
60
NMR của RG3 phù hợp cho dạng đồng phân lập thể rel- (5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R) với tỉ lệ phù hợp là 100%.
Cuối cùng, cấu hình tuyệt đối của hợp chất RG3 được xác định là 5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R bằng cách so sánh phô ECD thực nghiệm của hợp chất này với phô ECD được tính toán TD-DFT của đồng phân 5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R.
Hình 3.24. Các tương tác NOESY của hợp chất RG3
Hình 3.25. Phổ ECD thực nghiệm của hợp chất RG3 và phổ ECD tính toán theo lý thuyết của dạng đồng phân 5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG3 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 a đo trong CDCl3,b 125MHz, c500MHz. Hình 3.26. Phổ (+)-HR-ESI-MS của hợp chất RG3
Hình 3.27. Phổ (-)-HR-ESI-MS của hợp chất RG3
Hình 3.28. Phổ 1H NMR của hợp chất RG3
63
Hình 3.29. Phổ 13C NMR của hợp chất RG3
Hình 3.30. Phổ HSQC của hợp chất RG3
Hình 3.31. Phổ HMBC của hợp chất RG3
Hình 3.32. Phổ COSY của hợp chất RG3
65
Bảng 3.6. Kết quả tính toán lý thuyết phô 13
C NMR cho hai dạng đồng phân lập thể rel-(5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R) và
rel-(5R,8S,9S,10R,12S,16R,23S) theo phương pháp GIAO và áp dụng mô hình STS . (Isomer 1 = rel-23R, Isomer 2 = rel-23S)
Hình 3.33. Phổ NOESY của hợp chất
RG3 3.1.1.4. Hợp chất RG4: rhabdastrenone A (hợp chất mới)
Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất RG4
Hợp chất RG4 thu được dưới dạng dầu, không màu. Trên phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất này xuất hiện pic ion phân tử m/z [M+H]+: 437,3040 cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất là C29H40O3 (tính toán lí thuyết cho công thức phân tử C29H41O3: 437,3056), từ đó tính được độ bất bão hòa bằng 10. Trên phô cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H NMR của hợp chất RG4 xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm methyl dạng singlet tại δH 0,78, 1,05, 1,12, 1,42, 2,00 và 2,10, (3H, s); 1 nhóm methyl dạng singlet tại δH 1,11 (3H, t, J= 6,5 Hz); 5 tín hiệu proton olefin tại δH 6,73 (d, J = 15.5 Hz), 6,92 (dt, J = 6.5, 15,5 Hz), 6,97 (dd, J = 11,0, 15,5 Hz), 7,20 (d, J = 16,0 Hz) và 8,32 (d, J = 15,5 Hz). Trên phô 13
C NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 29 nguyên tử carbon trong đó có 3 carbon thuộc nhóm carbonyl tại δC 192,1, 206,4 và 218,9; 8 tín hiệu carbon vùng trường
67
thấp δC 124,1, 129,7, 138,5, 138,6, 139,2, 141,7, 147,7 và 149,2 gợi ý sự xuất hiện của bốn nối đôi C-C; 18 tín hiệu carbon ở vùng trường cao. Qua những dấu hiệu nhận biết từ phô 1H-, và 13
C NMR cho thấy hợp chất RG4 thuộc lớp chất isomalabaricane, lớp chất đặc trưng của giống Rhabdastrella. Như vậy, với độ bất bão hòa bằng 10, đã bao gồm 4 liên kết đôi và 3 nhóm carbonyl nên còn lại ba chỉ số thuộc về hệ 3 vòng ngưng tụ 6,6,5-tricyclic. Các tương tác trực tiếp từ proton liên kết đến carbon của hợp chất RG4 được xác định dựa trên phô HSQC. Tiếp tục phân tích các tương tác COSY và HMBC để xác định các mảnh cấu trúc của hợp chất
RG4. Các proton cạnh nhau tương tác trên phô COSY, bao gồm H2-1 (δH 1,52 và