4. Những đóng góp mới của luận án
1.3.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống ở đậu tương
Chỉnh sửa hệ gen là kỹ thuật tạo ra những thay đổi trên trình tự gen nội sinh theo cách có chủ đích tại một vị trí xác định khác với đột biến gen. Công nghệ chỉnh sửa gen tạo ra các đặc tính ưu việt cho cây trồng. Đến nay có 24 đối tượng cây trồng, với ít nhất 193 gen đã được chỉnh sửa bằng hệ thống này [57].
Kanazashi đã chuyển gen thông qua Agrobacterium sử dụng một sgRNA gây đột biến định hướng đồng thời hai locus GmPPD trong đậu tương. Các đột biến ở locus GmPPD được xác nhận trong ít nhất 33% hạt T2 [58]. Ngoài ra, trên cùng một gen mục tiêu, sử dụng cùng một cấu trúc CRISPR/Cas9 nhưng các sgRNA khác nhau có thể dẫn đến hiệu quả đột biến khác nhau [59].
Nhóm nghiên cứu của Mengyan Bai đã khai thác 74 gen liên quan đến việc hình thành nốt sần ở rễ và 28 gen chức năng có trong hạt đậu tương để cải tạo di truyền, xây dựng quần thể đột biến gen mục tiêu [60]. Jie Wang và cộng sự đã thành công trong việc tạo giống đậu tương cải biến gen tạo hạt không chứa lipoxygenase (chất tạo mùi đặc trưng) được qui định bởi ba gen (LOX1, LOX2, LOX3). Hệ thống CRISPR/Cas9 được thiết kế nhắm mục tiêu vào ba gen GmLox (GmLox1, GmLox2
và GmLox3) đã được áp dụng, 60 cây chuyển gen T0 dương tính được tạo ra, mang các tổ hợp của sgRNA và đột biến. Thử nghiệm so màu cho thấy rằng các cây mang các tổ hợp đột biến khác nhau đã mất các hoạt động lipoxygenase tương ứng. Các đột biến không chuyển gen thu được bằng cách sàng lọc thế hệ T2 của các dòng đột biến không có lipoxygenase (GmLox-28 và GmLox-60) [61].
Công nghệ CRISPR/Cas9 được sử dụng để tạo ra các vector loại trực tiếp đột biến đơn và kép các gen chức năng mã hóa enzyme sinh tổng hợp axit béo họ FAD2. Xác định trình tự của gen mục tiêu thể hiện hiệu suất chỉnh sửa gen
GmFAD2-03 và GmFAD2-2A lần lượt là 95% và 55,56%, hiệu suất chỉnh sửa đột biến kép là 66,67%.Kết quả ở thế hệ T2, hạt đậu tương có hàm lượng axit oleic tăng từ 17,10% lên 73,50%; hàm lượng axit linoleic giảm từ 62,91% xuống 12,23%; hàm lượng protein tăng từ 37,69% lên 41,16% [62].
CRISPR/Cas9 được Peipei Zhang và cộng sự ứng dụng trong nghiên cứu chỉnh sửa đa gen của cây đậu tương (GmF3H1, GmF3H2 và GmFNSI ‐1) nhằm cải thiện hàm lượng isoflavone và khả năng kháng virus khảm trên cây. Phân tích chuyển hóa của lá đột biến thế hệ T0 cho thấy hàm lượng isoflavone cải thiện đáng kể [63].
Zhaobo Liab và cộng sự đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng CRISPR/Cas9 gây đột biến có mục tiêu bốn gen LNK2 có nguồn gốc từ cây Arabidopsis thaliana
nhằm làm tăng thời gian ra hoa của đậu tương, kết quả thể đột biến tứ bội ra hoa sớm hơn đáng kể so với loại dại (WT) [64].
Zhandong Cai và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm loại bỏ gen GmJAG1 bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9, kết quả đã làm tăng năng suất giống đậu tương Huachun 6 trồng ở khu vực có vĩ độ thấp, năng suất của các dòng đột biến đã tăng lần lượt là 8,81% và 8,67% hơn giống đối chứng trong thử nghiệm mùa xuân và mùa hè [65].
Các dòng bất dục đực tế bào chất của đậu tương đã được sử dụng trong các hệ thống nhân giống lai ba dòng, tuy nhiên về ưu thế lai của đậu tương bị hạn chế bởi nguồn gen hiếm của các dòng bất dục. Bằng công nghệ CRISPR/Cas9, Xiao Chen và cộng sự đã chỉnh sửa mục tiêu tác động đến việc tổng hợp các chất tương đồng AMS có trong đậu tương để tạo ra các dòng bất dục đực ổn định. Việc chỉnh sửa có mục tiêu
GmAMS1 dẫn đến kiểu hình bất dục đực, trong khi chỉnh sửa GmAMS2 không tạo ra dòng bất dục đực. GmAMS1 không chỉ có chức năng trong việc hình thành màng phấn mà còn kiểm soát sự thoái hóa của tapetum đậu tương [66].
Hình 1.8. Chỉnh sửa gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9 trên một số loại cây trồng (giai đoạn tháng 8/2013-8/2018) [57].