4. Những đóng góp mới của luận án
3.3.2Sàng lọc cây chuyển gen bằng phết thuốc diệt cỏ và PCR
Việc chuyển gen thành công bước đầu được xác định thông qua phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l, sau đó được xác nhận bằng
sàng lọc PCR sự có mặt của trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen
pcoCas9 và vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC trong vector chuyển gen, cụ thể tại Bảng phụ lục 1. Các dòng đậu tương T0 được phết trực tiếp glufosinate 200 mg/l trên bề mặt lá. Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ, phần lá tại vị trí phết của cây đối chứng và một số dòng chuyển gen co lại, mất dần sắc tố xanh lục của lá và chuyển vàng; và sau
5ngày phết, vị trí lá thử chất diệt cỏ chuyển sang vàng nâu, cháy khô (Hình 3.12F). Bên cạnh đó, một số dòng chuyển gen không xuất hiện dấu hiệu gây hại của chất diệt cỏ tại vị trí thử, lá không bị mất màu màu sắc (Hình 3.12E).
Tổng hợp kết quả sau khi sàng lọc bằng thuốc diệt cỏ, đã thu được 3 dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0 không mẫn cảm với glufosinate 200 mg/l, trong đó có 1 dòng thuộc giống ĐT26 (DT1.1) và 2 dòng thuộc giống Mr (M3.1 và M4.1) (Bảng phụ lục 2). Tất cả các dòng đậu tương phát triển tốt trên giá thể cũng được thu lá và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng phụ lục 1). Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho kết luận tương tự như kết quả sử dụng phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ (Bảng phụ lục 2).
Như vậy, chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen vào hai giống đậu tương ĐT26 và Mr. Các dòng đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9 tiếp tục được sử dụng để xác định và phân tích các đột biến định hướng trên các gen
GmGOLS ở các bước tiếp theo.