4. Những đóng góp mới của luận án
3.6.1Phân tích đột biến ngoài mục tiêu (off target)
Hoạt động ngoài mục tiêu (off-target) đã được báo cáo trong một số nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 [83].
Bảng 3.6 Các đột biến off-target có thể có ở các cây đột biến T2
Trình tự Trình tự GAGTCACACCCCTCAGT đích ACA Off- GAGTCAAGCCCC target có ACATGG thể có Trình tự GCACCTTCTCCGGGCATTG đích C Off- GCACTTACT target có GCAGG thể có
chân là trình tự nhận biết PAM; MMs: số vị trí sai khác so với trình tự định hướng thiết kế.
Trong quá trình lựa chọn mục tiêu bằng chương trình trực tuyến CCTop [93], hai vị trí có khả năng gây tạo đột biến ngoài trình tự mục tiêu lần lượt nằm trong gen Glyma.07G220600 và Glyma.09G169400 đã được xác định. Cả trình tự genome của giống đối chứng William 82 và các giống thử nghiệm (ĐT26 và Mr) đều chứa các vị trí ngoài mục tiêu tiềm năng có trình tự PAM giống hệt nhau và có 3-4 nucleotide không khớp bất cứ mục tiêu nào được sử dụng (Bảng 3.6).
Chúng tôi thực hiện các phân tích ngoài mục tiêu trên các dòng đột biến T2 và
T3 bằng cách giải trình tự các vùng bên ngoài mục tiêu trên hai gen
Glyma.07G220600 và Glyma.09G169400 (Hình 3.28).
Kết quả cho thấy không phát hiện hoạt động chỉnh sửa nào tại các vị trí ngoài mục tiêu, điều này cho thấy tính đặc hiệu cao trong chỉnh sửa gen sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 ở đậu tương.
Hình 3.28. Phân tích trình tự off-target trong genome của các dòng đậu tương đột biến thế hệ T2
Vùng tô xanh lá thể hiện trình tự sai khác so với trình tự đích, vùng tô xanh dương thể hiện trình tự nhận biết PAM