4. Những đóng góp mới của luận án
3.3.3 Xác định và phân tích các đột biến gen thu được trên cây đậu tương
gen T0
Sau khi xác định sự có mặt của hai gen chỉ thị, chúng tôi khuếch đại đặc hiệu vùng gen GmGOLS03 và GmGOLS19 từ DNA các dòng chuyển gen T0 và tiến hành biến tính - hồi tính sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide để xác định việc chỉnh sửa các gen định hướng.
Kết quả thể hiện ở Hình 3.13 đã xác định được 03 dòng đậu tương đột biến, trong đó ghi nhận đột biến đồng thời ở cả hai gen đích (GmGOLS03 và GmGOLS19)
ở 3 dòng T0 được kiểm tra (D1.1, M3.1, M4.1). Các băng vạch có kích thước khác với băng vạch xuất hiện ở mẫu đối chứng được ghi nhận xuất hiện ở cả ba mẫu T0 được kiểm tra cho cả hai gen, cho thấy hiệu quả cao trong việc chỉnh sửa hệ gen đậu tương sử dụng cấu trúc CRISPR/Cas9 đã thiết kế.
Hình 3.13. Phân tích sản phẩm PCR của các dòng đậu tương đột biến gen thế hệ T0 bằng kỹ thuật biến tính - hồi tính trên gel polyacrylamide 15%.
Mr: cây đối chứng giống Mr; DT: cây đối chứng giống ĐT26; M3.1, M4.1:các dòng đột biến giống Mr; D1.1: dòng đột biến giống ĐT26; M: thang DNA 100 bp.
Các đột biến được phân tích thông qua tách dòng và giải trình tự vùng gen đích ở các cây T0. Tương thích với kết quả phân tích PAGE, dữ liệu giải trình tự cho thấy các đột biến khác nhau được xẩy ra ở hai gen GmGOLS (Hình 3.14). Kích thước của đoạn mất thay đổi từ ∆-7 bp đến ∆-77 bp. Dòng DT1.1 chứa các thể khảm (chimeric) cho cả gen GmGOLS03 và GmGOLS19. Hai mẫu tách dòng mang đột biến mất đoạn lớn (∆-77 và ∆-32 bp) cũng như không đột biến ở gen GmGOLS03 đã được xác định từ dòng DT1.1.
Ngoài ra, chúng tôi cũng tìm thấy alen kiểu dại và hai alen đột biến (∆-7 bp và ∆-23 bp) trong gen GmGOLS19 ở dòng DT1.1. Các đoạn mất dự kiến ở hai gen
GmGOLS03 và GmGOLS19 cũng được quan sát thấy ở các dòng đậu tương chuyển gen M3.1 và M4.1 thuộc giống Mr. Điều đáng chú ý là tất cả ba dòng chuyển gen đều chứa đột biến mất đoạn ∆-23 bp giống hệt nhau giữa hai vị trí cắt Cas9 trong gen GmGOLS19. Ngoài ra, hầu hết các dạng đột biến mất đoạn được phát hiện (8/9) đềunằm giữa hai vị trí đích, thể hiện độ chính xác của cấu trúc CRISPR/Cas9 được thiết kế trong việc chỉnh sửa bộ gen đậu tương.
Hình 3.14. Trình tự của các vùng trình tự đích trên gen GmGOLS03 (A) và gen
GmGOLS19 (B) ở cây T0
Các trình tự đích (sgRNAs) được thể hiện bằng màu đỏ, các trình tự PAM được đánh dấu xanh nước biển. DT1.1: dòng đột biến giống ĐT26; M3.1, M4.1: các dòng đột biến giống Mr; a/b/c/d/e: các alen khác nhau ở mỗi dòng T0; ∆ thể hiện
sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0),mất nucleotide (-), thêm nucleotide (+)
Như vậy, kết quả PAGE và phân tích trình tự chỉ ra rằng tất cả các dòng đậu tương chuyển gen T0 (3/3) được tạo ra từ hai giống ĐT26 và Mr đều mang đột biến gây ra bởi CRISPR/Cas9 trong gen GmGOLS03 và GmGOLS19. Ngoài locus
GmGOLS19 của dòng M3.1, tất cả các vùng khác đều chứa hai hoặc nhiều alen đột biến cho thấy sự xuất hiện của các thể khảm, do đó đòi hỏi phải sàng lọc thêm thế hệ tiếp theo để xác định tính di truyền của các đột biến và lựa chọn các đột biến ổn định.