SÀNG LỌC KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP TỪ CÁC- 123docz.net

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1. SÀNG LỌC KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP TỪ CÁC THÀNH

THÀNH PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS

VELEZENSIS

Theo nghiên cứu của Hứa Thị Vy (2019) đã khảo sát khả năng đối kháng giữa nấm bệnh

Phytophthora sp. với vi khuẩn B. velezensis từ sinh khối nuôi cấy theo phương pháp cấy kép

với bán kính tản nấm sau 48 giờ là 0,5±0,01cm và hiệu lực kháng nấm là 88,89%. Sử dụng kết quả nghiên cứu của Hứa Thị Vy (2019) làm tiền đề để thực hiện việc sàng lọc khả năng đối kháng nấm bệnh Phytophthora sp. từ các thành phần trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn

B. velezensis. Qua đó, kết luận được những thành phần nào trong canh trường nuôi cấy vi

khuẩn B. velezensis có khả năng kháng nấm bệnh để tiếp tục đánh giá hiệu lực ức chế nấm Phytophthora sp. đối với từng thành phần. Từ đó làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng để

sản xuất các loại chế phẩm sinh học đa dạng hơn.

Hoạt tính kháng nấm được khảo sát theo phương pháp cấy kép và quan sát sự phát triển của sợi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm sau thời gian 48 giờ. Kết quả đối kháng được thể hiện ở Hình 3.1.

Hình 3.1. Khả năng kháng nấm Phytophthora sp. của các thành phần trong canh

A. Canh trường nuôi cấy; B. Dịch ngoại bào; C. Sinh khối tế bào vi khuẩn không gia nhiệt; D. Sinh khối tế bào vi khuẩn gia nhiệt ở 55ºC trong 15 phút; E. Enzyme ngoại bào; F. Thành phần phi enzyme; G. Đối chứng

Qua kết quả thử nghiệm cho thấy ở tất cả các thành phần nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis đều có khả năng kháng nấm bệnh Phytophthora sp.. Trong đó, thành phần canh trường nuôi cấy cho kết quả kháng nấm mạnh nhất (nấm không xuất hiện tơ mọc lan sau 48 giờ). Thành phần phi enzyme của vi khuẩn B. velezensis vẫn có sự kháng nấm, tuy nhiên kết quả đối kháng yếu hơn các thành phần nuôi cấy khác (xuất hiện tơ nấm mọc lan sau 48 giờ). Như vậy, có thể kết luận được tất cả các thành phần trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis đều có khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua.

Từ kết quả của thử nghiệm này tiếp tục thực hiện đánh giá hiệu lực đối kháng nấm

Phytophthora sp. từ các thành phần trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis.

3.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP. TỪ CÁC THÀNH PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS

VELEZENSIS

3.2.1. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ tế bào vi khuẩn B. velezensis

Tế bào vi khuẩn được thu từ canh trường nuôi cấy khi đạt giá trị OD600= 0,7 bằng phương pháp ly tâm với tốc độ 10000 vòng trong 10 phút. Sau đó phần sinh khối được chia làm 2 mẫu thí nghiệm: một mẫu tiến hành gia nhiệt ở 55ºC trong 15 phút và mẫu còn lại không gia nhiệt. Các mẫu thí nghiệm đều được pha loãng theo dãy nồng độ đến 10-4, 10-5, 10-6 để tiến hành đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của sợi tơ nấm trong điều kiện PTN sau 5 ngày và 7 ngày ở nhiệt độ 30ºC.

a. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ sinh khối tế bào không gia nhiệt

Kết quả hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora sp. từ sinh khối tế bào không gia nhiệt của vi khuẩn B. velezensis được biểu thị ở Bảng 3.1 và Hình 3.2:

Bảng 3.1. Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ sinh khối tế bào không gia nhiệt.

Mẫu Bán kính tản nấm (cm) Hiệu lực kháng nấm (%) Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày

Đối chứng 4,5 4,5 - -

10-4 0,7±0,1d 1,1±0,1c 84,44±2,22a 75,56±2,22b 10-5 1,13±0,15c 1,53±0,06b 74,82±3,39b 65,92±1,28c

10-6 4,5a 4,5a - -

(Số liệu trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau trong bảng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%)

Hình 3.2. Khả năng đối kháng nấm từ tế bào không gia nhiệt của vi khuẩn B.

velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ:

A.10-4 ; B. 10-5 ; C. 10-6 ; D. Đối chứng

Kết quả cho thấy rằng trong điều kiện phòng thí nghiệm, sinh khối tế bào vi khuẩn B.

velezensis không gia nhiệt được pha loãng đến nồng độ 10-4 và 10-5 có hiệu lực ức chế mạnh đối với nấm bệnh Phytophthora sp., đạt giá trị tương ứng là 84,44% và 74,82% sau 5 ngày

theo dõi. Mặc dù hiệu lực ức chế nấm Phytophthora sp. ở các nồng độ sinh khối tế bào vi

khuẩn B. velezensis có chiều hướng giảm sau 7 ngày nhưng khả năng đối kháng với nấm bệnh vẫn còn khá cao, cụ thể hiệu lực ức chế tại nồng độ 10-4 là 75,56% và tại nồng độ 10-5 là 65,92%.

Như vậy, có thể kết luận sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis có khả năng kháng nấm bệnh Phytophthora sp. rất mạnh.

b. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ sinh khối tế bào gia nhiệt ở 55ºC trong vòng 15 phút

Kết quả hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora sp. từ sinh khối tế bào gia nhiệt ở 55ºC của vi khuẩn B. velezensis được biểu thị ở Bảng 3.2 và Hình 3.3:

Bảng 3.2.Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ tế bào gia nhiệt ở 55°C. Mẫu Bán kính tản nấm (cm) Hiệu lực kháng nấm (%) Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày

Đối chứng 4,5 4,5 - -

10-4 1,5±0,17d 2,6±0,15c 66,67±3,84a 40,74±4,62b 10-5 2,67±0,2c 3,3±0,1b 41,48±3,39b 26,67±2,22c

10-6 4,5a 4,5a - -

Hình 3.3. Khả năng đối kháng nấm từ tế bào được gia nhiệt ở 55°C của vi khuẩn B.

velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ:

A.10-4 ;B. 10-5 ; C. 10-6 ; D. Đối chứng

Sau khi gia nhiệt ở 55°C, sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis vẫn thể hiện hiệu lực kháng nấm lên đến 66,67% ở nồng độ 10-4 sau 5 ngày theo dõi. Nhìn chung, sau 7 ngày theo dõi thì hiệu lực ức chế nấm bệnh đã giảm rõ rệt nhưng vẫn còn thể hiện khả năng đối kháng khi hiệu lực ức chế vẫn trên 40%. Ở nồng độ 10-5, hiệu lực ức chế nấm bệnh Phytophthora sp. không cao, chỉ đạt mức 41,48% sau thời gian 5 ngày và giảm dần sau đó.

Qua kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy rằng sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis không gia nhiệt hoặc gia nhiệt vẫn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh

Phytophthora sp. mặc dù đã được pha loãng qua nhiều nồng độ. Trong đó, hiệu lực ức chế nấm bệnh từ sinh khối tế bào vi khuẩn không gia nhiệt cao hơn so với hiệu lực ức chế nấm của sinh khối tế bào vi khuẩn gia nhiệt ở 55°C là 17,77% khi đều được pha loãng đến nồng độ 10-4 sau 5 ngày theo dõi. Điều này có thể được giải thích là do khả năng cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh Phytophthora sp. và khả năng sinh một số hợp chất có hoạt tính kháng nấm (Adetomiwa Ayodele Adeniji và cs, 2019). Như vậy, ngoài khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ sinh khối tế bào vi khuẩn bình thường thì khi gặp điều kiện bất lợi (gia nhiệt) tế

bào vi khuẩn B. velezensis có thể giải phóng một số hoạt chất nội bào có thể là các chất có

hoạt tính kháng nấm được sinh ra bên trong cũng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua.

Theo nghiên cứu của Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học thì trong điều kiện nhà lưới, các tế bào vi khuẩn đối kháng nấm bệnh còn có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Hơn nữa, tế bào của các chủng vi khuẩn đối kháng Bacillus giúp hạt nảy mầm tốt hơn thông qua khả năng cộng sinh trong hệ rễ, chiếm

chỗ của nấm bệnh trong hệ rễ và đồng thời còn tiết ra hoạt chất ức chế nấm bệnh phát triển. Cùng với kết quả từ thí nghiệm này giúp tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng tế bào vi khuẩn

B. velezensis làm chế phẩm sinh học ứng dụng vào việc phòng ngừa bệnh sương mai bởi nấm Phytophthora sp. trên cây cà chua.

3.2.2. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ dịch ngoại bào của vi khuẩn B. velezensis

Kết quả hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora sp. từ dịch ngoại bào thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.4:

Bảng 3.3.Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ dịch ngoại bào.

Mẫu Bán kính tản nấm (cm) Hiệu lực kháng nấm (%)

Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày

Đối chứng 4,5 4,5 - -

10-6 0,9±0,1e 1,2±0,2d 80,00±2,22a 73,33±4,44b

10-7 1,43±0,06c 1,63±0,11b 68,14±1,28c 63,70±2,56d

10-8 4,5d 4,5d - -

Hình 3.4. Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. từ dịch ngoại bào của vi khuẩn B.

velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ:

A.10-6 ; B. 10-7 ; C. 10-8 ; D. Đối chứng

Kết quả thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.4 cho thấy các nồng độ pha loãng của dịch nổi sau khi ly tâm từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis đều có hiệu lực kháng nấm và có sự khác biệt có ý nghĩa. Hiệu lực kháng nấm giảm dần khi nồng độ pha loãng tăng dần. Hiệu lực kháng nấm sau 5 ngày cao hơn sau 7 ngày ủ ở cùng nhiệt độ 30ºC. Trong đó, dịch ngoại bào sau khi ly tâm từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn được pha loãng đến nồng độ 10-6

vẫn thể hiệu lực kháng nấm mạnh sau 5 ngày lên đến 80% và bắt đầu giảm dần xuống còn 73,33% sau thời gian 7 ngày.

Theo một số nghiên cứu thì vi khuẩn B. velezensis sản sinh ra nhiều hợp chất ngoại bào có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây. Một số hoạt chất tiêu biểu như lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias và cs, 2009; Huang và cs, 2014). Bên cạnh đó, nhiều chủng B. velezensis còn có khả năng sản sinh đồng thời các polyketide là difficidin, bacillaene và macrolactin (Arguelles-Arias và cs, 2009; Yuan và cs, 2012). Qua đó, có thể kết luận trong dịch ngoại bào của vi khuẩn B. velezensis có chứa các hợp chất có hoạt tính kháng nấm bệnh Phytophthora sp..

So sánh với kết quả nghiên cứu của Caulier S và cs (2018) thì chủng vi khuẩn B. velezensis với cơ chế đối kháng từ dịch ngoại bào và tế bào vi khuẩn cao hơn 4,44% so với

các chủng Bacillus sp. và Pseudomonas spp. đối kháng nấm bệnh Phytophthora infesians từ sinh khối vi khuẩn.

Còn nếu so sánh hiệu lực kháng nấm của dòng R33 với nấm Phytophthora capcisi trong kết quả nghiên cứu của Lee. K. J và cs 2008 là 86,8% từ sinh khối vi khuẩn thì hiệu lực kháng nấm của chủng vi khuẩn B. velezensi vẫn cao hơn (2,08%) (Hứa Thị Vy, 2019). Trong đó,

hiệu lực kháng nấm Phytophthora sp. từ dịch ngoại bào của vi khuẩn B. velezensis đã pha

loãng đến nồng độ 10-6 vẫn khá cao (80%).