Flavonoid là nhóm hoạt chất chính chiếm số lƣợng nhiều trong thành phần hoá học của cây, rutin chiếm tỉ lệ lớn nhất (6 − 38% rutin trong nụ) [3].
Nụ hoa hoè chứa nhiều và chủ yếu là rutin, Hoè Việt Nam có hàm lƣợng rutin cao, có tỉ lệ từ 6 − 30% có thể lên tới 38% trong nụ. Phần aglycon của rutin là quercetin (= Quercetol) thuộc nhóm flavonol, phần đƣờng là Rutinose [2].
Hình 1.15. Một số hợp chất hoá học có trong nụ hoa hòe
Ngoài ra trong Hoa hoè còn có các hoạt chất khác nhƣ Betulin, Lupan, Sophoradiol, Sophorin A, Sophorin B và Sophorin C và một số alcaloid nhƣ Oxymatrine, cytisin, N-methyl cytisin, sophocarmin, matrin [9]. Trong đó, Betulin là một dẫn chất triterpenoid thuộc nhóm Lupan, Sophoradiol là dẫn chất thuộc nhóm olean [2], [3], [18].
a) Sắc tố vàng của họ flavonoid
Flavonoid là những hợp chất phenol màu thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa... Phần lớn các flavonoid có màu vàng. Tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đuợc xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sƣờn căn bản. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thƣờng đuợc gọi là C6-C3-C6. Cách đánh số tùy theo mạch C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
Hình 1.16. Cách đánh số thứ tự trên cấu trúc của Flavonoid [15]
Thƣờng các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hay dạng glycosid. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là đƣờng D-glucose, D-galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic. Sắc tố vàng của họ flavonoid đƣợc tìm thấy trong tự nhiên bao gồm các chalcone, hợp chất dị vòng và một vài flavonol. Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên, flavonol và glavanonol cũng hiếm gặp, flavon và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glycosid flavonol nhƣ: rutin, quercitrin, kaem pherol rất thuờng xuất hiện. Do có nhiều nhóm –OH phenol nên các flavonoid có thể liên kết với nhau để tạo thành phức tạp hơn hoặc tạo với các hợp chất khác. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu vàng đến màu vàng nhạt; chalcone có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocuanidin, catechin kết tinh không màu. Hầu hết các sắc tố vàng họ flavonoid trong tự nhiên xuất hiện đồng thời với họ carotenoid để hấp dẫn các loại
côn trùng thụ phấn cho cây hoặc bảo vệ thực vật chống lại tia UV. Các flavonoid đƣợc phân thành nhiều nhóm với cấu trúc cơ bản khác nhau, dựa vào chu trình sinh tổng hợp, đƣợc trình bày trong sơ đồ chuyển hóa các flavonoid sau:
Hình 1.17. Sơ đồ chuyển hóa các flavonoid
Các hợp chất dị vòng tạo ra các sắc tố vàng đậm, nhƣng chỉ mô tả nhóm nhỏ nhất của các hợp chất flavonoid đƣợc nhận biết. Các hợp chất dị vòng có thể hình thành bởi quá trình oxi hóa các chalcone trong quá trình trích ly tách và tinh chế sản phẩm. Các chalcone hoạt động nhƣ là trạng thái trung gian của nhiều màu sắc trong quá trình tổng hợp sinh học. Các chalcone với một nhóm hydroxyl tự do hoặc không bị thay thế ở vị trí C6 tự đóng vòng tạo flavonol không màu. Các flavonol sinh ra các màu vàng nhạt hơn so với các sắc tố flavonoid bởi vì chúng hấp thu ở dải bƣớc sóng thấp hơn. Hầu hết các flavonol có cộng thêm một nhóm hydroxyl nhuộm vào vòng A, phổ biến là vị trí C8. Tất cả màu vàng sinh ra từ flavonoid nhạt đi dƣới tác động của pH, nhiệt độ, tác nhân oxy hóa…[21].
b) Giới thiệu về rutin
Rutin có tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-{[( 2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-({[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6- methyloxan-2-yl]oxy} methyl) oxan-2-yl] oxy}-4H-chromen-4-one hay có tên khác là : 3, 3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon 3-Rutinosid.
Rutin là một glucosid chiết đƣợc từ nụ hoa cây Hòe (S. japonicum L), họ Đậu (Fabaceae), hoặc từ nhiều cây khác thuộc các họ thực vật khác nhau. Rutin là một chất thuộc nhóm Flavon, có phần aglycon là Quercetin thuộc nhóm Flavonol [2], [5].
Hình 1.18. Cấu trúc hoá học của Rutin và Quercetin
Tính chất vật lý [4] :
- Bột kết tinh màu vàng hay vàng lục.
- Tan trong methanol và trong các dung dịch hydroxyd kiềm, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong nƣớc lạnh và dichloromethan.
- Phổ của rutin có λmax ở 362,5 và 258 nm, ở λ = 362,5 nm thì có E (1%, 1cm) = 325 (ethanol) [2].
CHƢƠNG 2
THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
Nụ hoa hòe đƣợc mua tại chợ Cồn, thành phố Đà Nẵng, có nguồn gốc chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, tập trung nhiều ở làng quê Thái Bình. Nụ hoa hòe đã đƣợc sấy khô, có màu vàng sẫm, đƣợc loại bỏ các hạt lép, hạt sấy bị cháy, rác, sàng lọc bỏ bột cặn và bảo quản trong lọ kín.
Hình 2.1. Nụ hoa hòe đã xử lí sơ bộ
Vải tơ tằm 100% đƣợc sản xuất tại công ty lụa Mã Châu, thị trấn Nam Phƣớc, huyện Duy Xuyên, tỉnh Quảng Nam đã đƣợc tẩy hồ trƣớc khi nhuộm.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng
STT Hóa chất Xuất xứ Độ tinh khiết
1 NaOH Trung Quốc ≥ 96%
2 Al2(SO4)3.18H2O Trung Quốc ≥ 99%
4 CH3OH Đức ≥ 99%
5 C2H5OH Trung Quốc ≥ 99,7%
6 C6H14 Trung Quốc ≥ 95%
7 CH3COOC2H5 Trung Quốc ≥ 99,5%
8 CHCl3 Việt Nam ≥ 94%
9 Bột giặt Omo Việt Nam
2.1.3. Hệ thống thiết bị và dụng cụ
Hệ thống thiết bị và dụng cụ cho nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Hệ thống thiết bị và dụng cụ sử dụng
Thiết bị Dụng cụ
Bộ dụng cụ chƣng ninh Máy đo quang UV-Vis Máy đo pH Tủ sấy Bếp cách thủy Cân phân tích Bộ lọc chân không Bình cầu Cốc thủy tinh Bình tam giác Bình định mức (25ml, 50ml,1000ml) Các loại pipet Giấy lọc Nhiệt kế dầu
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết tách dịch màu từ nụ hoa hòe với nhiệt độ chiết tách, thời gian chiết tách, tỉ lệ rắn/lỏng (nguyên liệu/dung môi), pH của dung môi.
- Phân tích và nhận diện các hợp chất mang màu trong dịch chiết từ nụ hoa hòe bằng phƣơng pháp phân tích hiện đại: UV-VIS, GC-MS.
- Nghiên cứu tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhuộm vải bằng các chất màu chiết tách từ nụ hoa hòe nhƣ nhiệt độ nhuộm, thời gian nhuộm, số lần nhuộm, chất cầm màu cho vải sau nhuộm.
- Đánh giá độ bền màu với giặt của vải nhuộm bằng dịch chiết từ nụ hoa hòe.
Hình 2.3. Quy trình trích ly chất màu từ nụ hoa hòe
Chiết tách bằng phƣơng pháp chƣng ninh
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết tách Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình chiết tách
pH của dung môi Nhiệt độ
chiết tách
Đánh giá dịch chiết Đo UV-VIS Xác định mật độ quang Xử lí sơ bộ Thời gian chiết tách Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Nụ hoa hòe
Quá trình trích ly chất màu từ nụ hoa hòe trong dung môi nƣớc đƣợc thực hiện nhƣ Hình 2.3, với những điều kiện tối ƣu về nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi.
Từ dịch chiết nụ hoa hòe trong nƣớc và các dung môi hữu cơ: n-hexan, chloroform và ethyl acetate tiến hành chiết lỏng-lỏng, đo GC-MS để xác định thành phần các chất hữu cơ trong dịch chiết tƣơng ứng với từng dung môi đƣợc thực hiện nhƣ Hình 2.4.
Hình 2.4. Quy trình xác định thành phần dịch chiết từ nụ hoa hòe bằng GC-MS
- Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết nụ hoa hòe với dung môi ethanol
Quá trình trích ly chất màu từ nụ hoa hòe trong dung môi ethanol đƣợc thực hiện nhƣ Hình 2.5. Dịch chiết đƣợc đem đo GC-MS để xác định thành phần các chất hữu cơ.
Hình 2.5. Quy trình xác định thành phần
dịch chiết từ nụ hoa hòe với dung môi ethanol bằng GC-MS
Dịch chiết nƣớc nụ hoa
hòe
Chiết với dung môi hữu cơ
Dịch chiết
Đo GC-MS
Kết quả
Nụ hoa hòe + ethanol Đun trong bếp cách thủy, để nguội. Hỗn hợp dịch chiết Lọc Dịch chiết Đo GC-MS Kết quả
Dịch chiết tối ƣu trích ly từ nụ hoa hòe đƣợc nhuộm trên vải tơ tằm 100% theo sơ đồ Hình 2.6.
Hình 2.6. Quy trình nhuộm vải
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp trích ly chất màu thiên nhiên
Luận văn sử dụng phƣơng pháp trích ly ngâm (chiết ngâm) để trích ly chất màu từ nụ hoa hòe. Phƣơng pháp trích ly chiết ngâm hay còn gọi là đun cách thủy đƣợc tiến hành ở nhiệt độ dƣới 1000C, ở áp suất 1 atm (hay 101.325 Pa), là phƣơng pháp tƣơng đối đơn giản và dễ lắp đặt, gia nhiệt gián tiếp qua nƣớc, tránh hiện tƣợng quá nhiệt khi đun nóng, hạn chế đƣợc hiện tƣợng cháy chất cần đun. Bên cạnh đó, sử dụng nhiệt gián tiếp từ nƣớc sẽ góp phần kiểm soát đƣợc nhiệt độ và
Dịch chiết tối ƣu từ quá trình chiết tách
Nhuộm vải tơ tằm
Nhiệt độ nhuộm
Thời gian nhuộm Số lần nhuộm Chất cầm màu
Xử lí sau nhuộm
Sản phẩm nhuộm
Đánh giá độ bền màu với giặt
giảm nhiệt nhanh nếu tăng cao hơn so với nhiệt độ khảo sát [10]. Phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ tách chất màu thiên nhiên từ thực vật.
Quá trình chiết tách chất màu từ nụ hoa hòe đƣợc thực hiện trên bộ chƣng ninh tại phòng thí nghiệm trƣờng Đại học Sƣ Phạm Đà Nẵng.
2.3.2. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis
Để xác định sơ bộ thành phần các nhóm chức có thể tồn tại trong dịch chiết, xác định số nối đôi liên hợp, bƣớc sóng cực đại, độ hấp thu quang A, tính độ tận trích của dịch chiết lên vật liệu, thông thƣờng xác định bằng cách kiểm tra quang phổ khả kiến - tử ngoại (UV-Vis). Một số ít nhóm chức có thể xác định nhờ phổ UV-VIS, nhƣng đặc biệt hữu ích là xác định sự có mặt và giải thích bản chất của các hệ liên hợp có vòng thơm. Các chất có màu là do trong phân tử của các chất chứa nhiều nhóm nối đôi hay nối ba nhƣ C=C, C=O, C=N, N=N, ,
NO2… Do vậy, chúng đƣợc gọi là nhóm mang màu. Nếu trong phân tử có nhiều nhóm mang màu liên hợp tạo thành mạch dài thì màu của chất sẽ càng đậm. Các chất màu đậm khi đo phổ tử ngoại khả kiến cho λmax nằm ở vùng có bƣớc sóng dài. Dựa vào λmax, có thể biết đƣợc loại liên kết:
λmax< 150nm: chỉ có loại liên kết σ của hợp chất no λmax > 150 nm: có liên kết đôi
λmax quanh vùng 200÷260 nm có thể có benzen và dẫn xuất của benzen λmax >280 nm: hệ liên hợp
λmax càng lớn thì hệ liên hợp càng dài. Hầu hết các phân tử hữu cơ trong suốt trong một phần của phổ điện tử đƣợc gọi là vùng tử ngoại (Ultraviolet-UV) và vùng khả kiến (visible-VIS) với các bƣớc sóng từ 190÷800 nm. Phổ tử ngoại và khả kiến của hợp chất hữu cơ gắn liền với các mức năng lƣợng electron. Nói chung các bƣớc chuyển xảy ra giữa một orbitan liên kết hay cặp electron không chia sẻ và một orbitan không liên kết hay phản liên kết. Khi đó bƣớc sóng hấp thụ là số đo khoảng cách của các mức năng lƣợng giữa các orbitan. Khoảng cách năng lƣợng lớn nhất đƣợc tìm thấy khi các electron ở liên kết bị kích thích, cho hấp thụ trong vùng 120÷200 nm. Có hai định luật thực nghiệm đƣợc sử dụng tính cƣờng độ hấp thụ.
Định luật Lambert phát biểu rằng phần tia tới bị hấp thụ phụ thuộc vào cƣờng độ của nguồn. Định luật Beer phát biểu rằng sự hấp thụ tỷ lệ với phân tử hấp thụ. Từ các định luật này có phƣơng trình của định luật Beer-Lambert nhƣ sau :
A= log (2.1) Trong đó:
Io và I: cƣờng độ của tia tới và tia phản xạ tƣơng ứng L: chiều dày của dung dịch hấp thụ tính bằng cm C: nồng độ dung dịch tính bằng mol/L
ε: hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1
.cm-1), ε là đại lƣợng có giá trị theo thứ nguyên của C và L.
A: độ hấp thụ hay mật độ quang
Định luật chỉ đúng trong trƣờng hợp nồng độ chất phân tích tƣơng đối thấp. Tại những nồng độ cao (thƣờng lớn hơn 0,01 M) khoảng cách trung bình giữa các phân tử chất tan hấp thụ ánh sáng bị thu hẹp tới mức tác động đến sự phân bố điện tích của các phân tử xung quanh. Điều này làm thay đổi khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc, dẫn đến sai lệch mối quan hệ tuyến tính giữa A và nồng độ C của chất hấp thu bức xạ đó. Định luật Beer-Lambert đƣợc tuân theo hoàn toàn chỉ khi ánh sáng truyền qua thực sự đơn sắc. Tuy nhiên, định luật không thể tuân theo khi một số các phân tử khác đang hấp thụ nằm ở trạng thái cân bằng, khi chất tan và dung môi kết hợp tạo một số dạng phức, khi cân bằng nhiệt tồn tại giữa trạng thái electron cơ bản và trạng thái kích thích ở mức thấp, hay khi các hợp chất huỳnh quang hoặc các hợp chất bị biến đổi nhờ bức xạ có mặt trong dung dịch.
Độ truyền qua T đƣợc định nghĩa: T= (2.2) Phần trăm truyền qua T%: T%= .100 (2.3)
Mối quan hệ giữa mật độ quang A, độ truyền qua T nhƣ sau: A= - logT (2.4) Kết quả xác định UV-Vis đƣợc thực hiện trên thiết bị UV-Vis Spectrophotometer tại phòng thí nghiệm trƣờng Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng.
2.3.3. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS/ Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phƣơng pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC-MS đƣợc cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng. Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng kỹ thuật GC-MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành nhƣ y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Phƣơng pháp GC-MS đƣợc sử dụng trong luận văn nhằm mục đích phân tích các hợp chất mang màu cần định danh có mặt trong dịch chiết từ nụ hoa hòe. Kết quả GC-MS của luận văn đƣợc thực hiện trên thiết bị GC-MS tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng 2, thành phố Đà Nẵng.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHỔ UV-VIS CỦA DỊCH CHIẾT NỤ HOA HÒE
Sử dụng máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để xác định λmax của dịch chiết nụ hoa hòe trong khoảng bƣớc sóng từ 400 nm đến 600 nm, kết quả tại λ = 425 nm xuất hiện peak cực đại (Hình 3.1). Do đó, giá trị λmax= 425 nm đƣợc sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly chất màu và quá trình nhuộm vải.
Hình 3.1. Phổ UV-Vis dịch chiết nụ hoa hòe
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY CHẤT MÀU TỪ NỤ HOA HÒE TRÍCH LY CHẤT MÀU TỪ NỤ HOA HÒE
3.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly chất màu từ nụ hoa hòe