Để xác định sơ bộ thành phần các nhóm chức có thể tồn tại trong dịch chiết, xác định số nối đôi liên hợp, bƣớc sóng cực đại, độ hấp thu quang A, tính độ tận trích của dịch chiết lên vật liệu, thông thƣờng xác định bằng cách kiểm tra quang phổ khả kiến - tử ngoại (UV-Vis). Một số ít nhóm chức có thể xác định nhờ phổ UV-VIS, nhƣng đặc biệt hữu ích là xác định sự có mặt và giải thích bản chất của các hệ liên hợp có vòng thơm. Các chất có màu là do trong phân tử của các chất chứa nhiều nhóm nối đôi hay nối ba nhƣ C=C, C=O, C=N, N=N, ,
NO2… Do vậy, chúng đƣợc gọi là nhóm mang màu. Nếu trong phân tử có nhiều nhóm mang màu liên hợp tạo thành mạch dài thì màu của chất sẽ càng đậm. Các chất màu đậm khi đo phổ tử ngoại khả kiến cho λmax nằm ở vùng có bƣớc sóng dài. Dựa vào λmax, có thể biết đƣợc loại liên kết:
λmax< 150nm: chỉ có loại liên kết σ của hợp chất no λmax > 150 nm: có liên kết đôi
λmax quanh vùng 200÷260 nm có thể có benzen và dẫn xuất của benzen λmax >280 nm: hệ liên hợp
λmax càng lớn thì hệ liên hợp càng dài. Hầu hết các phân tử hữu cơ trong suốt trong một phần của phổ điện tử đƣợc gọi là vùng tử ngoại (Ultraviolet-UV) và vùng khả kiến (visible-VIS) với các bƣớc sóng từ 190÷800 nm. Phổ tử ngoại và khả kiến của hợp chất hữu cơ gắn liền với các mức năng lƣợng electron. Nói chung các bƣớc chuyển xảy ra giữa một orbitan liên kết hay cặp electron không chia sẻ và một orbitan không liên kết hay phản liên kết. Khi đó bƣớc sóng hấp thụ là số đo khoảng cách của các mức năng lƣợng giữa các orbitan. Khoảng cách năng lƣợng lớn nhất đƣợc tìm thấy khi các electron ở liên kết bị kích thích, cho hấp thụ trong vùng 120÷200 nm. Có hai định luật thực nghiệm đƣợc sử dụng tính cƣờng độ hấp thụ.
Định luật Lambert phát biểu rằng phần tia tới bị hấp thụ phụ thuộc vào cƣờng độ của nguồn. Định luật Beer phát biểu rằng sự hấp thụ tỷ lệ với phân tử hấp thụ. Từ các định luật này có phƣơng trình của định luật Beer-Lambert nhƣ sau :
A= log (2.1) Trong đó:
Io và I: cƣờng độ của tia tới và tia phản xạ tƣơng ứng L: chiều dày của dung dịch hấp thụ tính bằng cm C: nồng độ dung dịch tính bằng mol/L
ε: hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1
.cm-1), ε là đại lƣợng có giá trị theo thứ nguyên của C và L.
A: độ hấp thụ hay mật độ quang
Định luật chỉ đúng trong trƣờng hợp nồng độ chất phân tích tƣơng đối thấp. Tại những nồng độ cao (thƣờng lớn hơn 0,01 M) khoảng cách trung bình giữa các phân tử chất tan hấp thụ ánh sáng bị thu hẹp tới mức tác động đến sự phân bố điện tích của các phân tử xung quanh. Điều này làm thay đổi khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc, dẫn đến sai lệch mối quan hệ tuyến tính giữa A và nồng độ C của chất hấp thu bức xạ đó. Định luật Beer-Lambert đƣợc tuân theo hoàn toàn chỉ khi ánh sáng truyền qua thực sự đơn sắc. Tuy nhiên, định luật không thể tuân theo khi một số các phân tử khác đang hấp thụ nằm ở trạng thái cân bằng, khi chất tan và dung môi kết hợp tạo một số dạng phức, khi cân bằng nhiệt tồn tại giữa trạng thái electron cơ bản và trạng thái kích thích ở mức thấp, hay khi các hợp chất huỳnh quang hoặc các hợp chất bị biến đổi nhờ bức xạ có mặt trong dung dịch.
Độ truyền qua T đƣợc định nghĩa: T= (2.2) Phần trăm truyền qua T%: T%= .100 (2.3)
Mối quan hệ giữa mật độ quang A, độ truyền qua T nhƣ sau: A= - logT (2.4) Kết quả xác định UV-Vis đƣợc thực hiện trên thiết bị UV-Vis Spectrophotometer tại phòng thí nghiệm trƣờng Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng.