Cơ sở lý thuyết của phương pháp GC/MS [27]

5. Bốc ục luận vă n

2.2.4. Cơ sở lý thuyết của phương pháp GC/MS [27]

Nguyên tắc: Nhờ có khí mang có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi

được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu được xử

lý ởđó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.

Chú ý: Bột cây trong ống D không nên cao hơn mức này Ống thông nhau E Nút mài (1) Bếp đun Dung môi Bình cầu Viên bi thủy tinh Túi vải chứa bột cây Ống ngưng hơi C Nút mài (2) Ống B

25

Cấu tạo: Thiết bịđược cấu tạo bởi 2 phần: phần sắc kí khí (GC) dùng để

phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần phổ khối (MS), mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối.

Sắc kí khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc kí khí chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là hóa chất, chất này có độ

nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu.

Sắc kí ghép khối phổ (GC/MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước... Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết. Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư

viện thì nhà nghiên cứu có thể dựa trên cấu trúc mới tìm ra được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học.

26

Ưu điểm của phương pháp: - Độ chính xác cao.

- Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ.

- Trang thiết bị không quá phức tạp.

- Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn hợp phức tạp.

- Kết quả thu nhận được một cách nhanh chóng (từ 1 - 100 phút ). - Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp.

Nhược điểm của phương pháp: - Độ bay hơi: Mẫu phải bay hơi được

- Độ bền nhiệt:Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt độ cao. - Khối lượng phân tử: Đặc trưng < 500 amu.

- Chuẩn bị mẫu:Dung môi phải bay hơi và có nhiệt độ sôi thấp hơn các chất phân tích.

- Lượng mẫu:Thường từ 1 –5 ml.

- Detecter – Đầu dò:Chỉ có pha động là mang mẫu.

- Cơ chế tách:Thông dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ. 2.3. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ

2.3.1. Xác định độ ẩm

Lấy 3 cốc sứ nhỏ có kí hiệu sẵn cho vào sấy ở nhiệt độ 100oC trong 3h, sau đó lấy ra bỏ vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ phòng và đem đi cân xác định khối lượng của mỗi cốc là mo (g). Lấy một khối lượng xác định bột lá chùm ruột và đem cân trên cân phân tích được m1 (g).

Cho bột lá chùm ruột vào các cốc sứ đã được chuẩn bị rồi đem đi sấy,

điều chỉnh ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 3h sau đó đem cân. Cứ như vậy

27

ẩm để làm nguội, cân được m2 (g). Độ ẩm mỗi mẫu được tính theo biểu thức sau (tính theo % khối lượng):

Độẩm (%) = Độẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu. Độẩmtb(%) = 5 (%) W 5 1 å Trong đó: mo: Khối lượng cốc sứ (g). m1: Khối lượng cốc sứ và mẫu trước khi sấy (g). m2: Khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g). Độẩm (%): Độẩm của mỗi mẫu. Độẩmtb (%): Độẩm trung bình. 2.3.2. Xác định hàm lượng tro

Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thểđộng vật, thực vật người ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu. Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung.

Mẫu vừa xác định độ ẩm (m2) được đem đi tro hóa bằng cách nung trong lò nung ở nhiệt độ 500 - 550oC (nếu ở nhiệt độ cao hơn thì một số kim loại sẽ

bay hơi) trong 6 - 10 tiếng, cho đến khi mẫu biến hoàn toàn thành tro trắng. Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

đến khối lượng không đổi, có khối lượng m3.

Hàm lượng tro chính là hiệu số giữa khối lượng cốc sau khi sấy và khối lượng mẫu sau khi đem tro hóa.

(%) 100 ) ( 1 2 1 - ´ + m m m mo

28 Hình 2.9. Mẫu bột lá chùm ruột đã tro hóa Công thức tính: Tro (%) = Trotb (%) = Trong đó: m1: Khối lượng mẫu(g) mo: Khối lượng cốc sứ (g) m3: Khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

Tro (%): Hàm lượng tro của mỗi mẫu

Trotb(%): Hàm lượng tro trung bình

2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan bằng dung dịch nước cường toan (3ml HCl và 1ml HNO3) định mức bằng nước cất đến 50ml. Lấy dung dịch đã

định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Cu, Pb, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng.

Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau:

( ) ( ) 50 1000 C mg l C mg kg m = ´ ´ m: khối lượng mẫu bột (g) (%) 100 1 3- ´ m m m o H (%) 5 5 1 å

29

2.4. CHIẾT SOXHLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT

Chuẩn bị 4 túi vải, cho 30g bột lá chùm ruột vào mỗi túi, sau đó tiến hành chiết soxhlet trong 250ml với các dung môi hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol bằng cách sử dụng nhiệt độ từ nồi cách thủy. Về cơ bản nhiệt độ bên ngoài từ nồi cách thủy điều chỉnh sao cho cao hơn nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 5 - 10oC để quá trình chiết soxhlet cứ 30 - 45 phút dịch chiết được rút xuống 1 lần.

Chiết kiệt chất trong bột lá chùm ruột trong 32 tiếng, kiểm tra đã chiết kiệt chưa bằng cách chấm một ít dịch trong hốc chiết lên miếng kính và để

cho dung môi bay hơi, nếu trên miếng kính không có vết gì chứng tỏđã chiết kiệt.

Hình 2.10. Hệ thống 4 ống sinh hàn dùng trong chiết soxhlet bột lá chùm ruột với các dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol

Gửi đo GC/MS để xác định thành phần hóa học có trong mỗi dịch chiết với chương trình chạy như sau:

- Thiết bị phân tích: GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent.

30 - ToC: 280oC, tốc độ: 1ml/phút. - Chương trình nhiệt độ buồng cột: 7o/phút 4o/phút 20o/phút 50oC 120oC 200oC 300oC (0 phút) (0 phút) (5 phút) (10 phút) 2.5. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH

2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến quá trình chiết bột lá chùm ruột chiết bột lá chùm ruột

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ sôi: Tiến hành chưng ninh 5 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột lá chùm ruột trong 100ml dung môi chiết thích hợp của dung môi ở toC: 50oC, 60oC, 70oC, 80oC và 90oC. Đem lọc và cô cạn các dịch chiết, thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau, cân cao thu

được. Chọn thời gian chiết thích hợp là thời gian tương ứng với khối lượng cao lớn nhất.

b. Ảnh hưởng của thời gian: Tiến hành chưng ninh 5 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột lá chùm ruột trong 100ml dung môi chiết thích hợp của dung môi ở thời gian: 2h, 4h, 6h, 8h và 10h. Đem lọc và cô cạn các dịch chiết, thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau, cân cao thu được. Chọn nhiệt độ chiết thích hợp là nhiệt độ tương ứng với khối lượng cao lớn nhất.

2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ rắn - lỏng đến quá trình chiết bột lá chùm ruột lá chùm ruột

Tiến hành chưng ninh 5 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột lá chùm ruột trong các thể tích 60ml, 80ml, 100ml, 120ml và 150ml dung môi chiết thích hợp với thời gian và nhiệt độ chiết thích hợp. Sau đó bù thêm dung

31

môi vào các mẫu sao cho tổng thể tích dung môi sử dụng cho mỗi mẫu là 150ml, lắc đều. Đem lọc và cô cạn các dịch chiết, thu được cao chiết ở các tỉ

lệ rắn - lỏng khác nhau, cân cao thu được. Chọn tỉ lệ rắn - lỏng thích hợp là tỉ

lệ rắn - lỏng tương ứng với khối lượng cao lớn nhất.

2.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến quá trình chiết bột lá chùm ruột chùm ruột

Tiến hành chưng ninh khoảng 10g bột lá chùm ruột trong dung môi và

điều kiện chiết thích hợp đã khảo sát được. Đem lọc, giữ lại bã bột lá chùm ruột và cô cạn dịch chiết thu được cao chiết, cân cao chưng ninh lần 1 có khối lượng là m1. Tiếp tục chưng ninh bã chùm ruột trong dung môi tối ưu, ở điều kiện chiết như trên thêm 2 lần nữa, cân cao chưng ninh lần 2, lần 3 có khối lượng lần lượt là m2, m3.

2.6. ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT TỪ LÁ CHÙM RUỘT CHO QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP BẰNG SẮC KÝ PHÂN LẬP BẰNG SẮC KÝ

Cân 1kg mẫu lá chùm ruột đã được xử lý. Ngâm mẫu trong 3 lít methanol trong 7 ngày, tiến hành ngâm liên tục 3 lần như vậy. Dịch chiết sau 3 lần gộp lại tiến hành chưng ninh thu được cao methanol là phần cặn tương

đối sệt. Hòa tan cao methanol trong nước cất, cho vào phễu chiết 1 lít. Tiến hành chiết lỏng - lỏng liên tục với hexane để loại chất béo và diệp lục tố. Huyền phù còn lại chiết lỏng lỏng với ethyl acetate, thu được cao ethyl acetate rồi đem cao ethyl acetate đi phân lập.

32

Hình 2.11. Các cao chiết hexane, ethyl acetate và methanol

2.7. KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG [6], [28]

Phương pháp này được Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi.

2.7.1. Nguyên tắc

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và

đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng

đồng nhất và được cốđịnh trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy

định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha

động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi

33

ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/ b

Trong đó:

a : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu.

b : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng

đường đi của vết, tính bằng cm.

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.

Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên. Nó cũng

được các nhà hóa học tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được trong phản ứng.

Nhược điểm của kỹ thuật:

- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển. - Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi.

- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn.

2.7.2. Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử Dụng cụ - Tủ hút hơi độc. - Ðèn tử ngoại. - Máy ảnh. - Máy sấy. - Bản mỏng.

34

- Dụng cụđể phun thuốc thử.

- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín. - Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20 ml, và các ống mao quản.

Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuric): Cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1,2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi khuấy được cho vào bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín.

Chuẩn bị bình triển khai

Bình triển khai dạng hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Dùng một mặt kính

đồng hồđậy kín bình triển khai để dung môi không bị bay hơi trong quá trình giải ly.

35

Chuẩn bị bản mỏng chạy sắc ký

Bản mỏng đã được tráng silicagel có kích thước 20x20 cm. Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 1x10 cm. Dùng bút chì mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1cm, mức tiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 0,5cm.

Chuẩn bị dịch chiết chạy sắc ký

Hòa tan 1 lượng nhỏ cao chiết ethyl acetatetrong dung môi ethyl acetate, sao cho cao tan tốt lại trong dung môi.

2.7.3. Cách tiến hành

Lựa chọn dung môi giải ly

Chọn dung môi triển khai tùy thuộc vào mẫu cần tách. Với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ không phân cực đến phân cực.

Chấm bản mỏng và sử dụng bình triển khai

Cho dung môi giải ly vào bình sao cho lớp dung môi dày khoảng 0,5 - 0,7 cm, để yên 5 - 10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình (nhờ tờ giấy lọc).

Dùng vi mao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dịch chiết ethyl acetate từ

lá chùm ruột, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn chứa dung dịch lên trên bản mỏng tại một điểm cách bản 1cm (điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).

Lưu ý: Chạm nhẹ vi quản vào bề mặt bản mỏng để không nhìn thấy lỗ

trên bề mặt và chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ (vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ

lan to). Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần nữa để có vết

36

một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và