5. Bốc ục luận vă n
2.8.7. Chọn phân đoạn tiếp tục khảo sát
Chọn phân đoạn có lượng cao nhiều và có hợp chất cần phân lập khi chạy GC/MS để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn có lượng cao ít, GC/MS cho nhiều tạp chất, rất khó khảo sát tiếp, vì nếu có cô lập được chất tinh khiết sẽ
không đủ lượng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp hóa lý hiện đại.
Chạy cột sắc ký phân đoạn: chọn cột sắc ký có đường kính 10 cm và chiều cao làm việc là 40cm , triển khai chạy với hệ dung môi hexane : EtOAc = 45:55. Cao phân đoạn EA1.5 cân được 0,393g, đem cao trộn với silicagel và giã mịn, cho chạy cột nhỏ với tốc độ hứng 4 - 5 giọt/ phút. Thu được 20 lọ
thủy tinh kí hiệu từ Aa1 đến Aa20 (từ lọ 17 trở đi thì không còn màu), cho bay hơi tự nhiên.
Dựa vào kết quả sắc ký bản mỏng, Aa1 đến Aa6 cho kết quả giống nhau, tiến hành gộp chung các lọ Aa1 đến Aa6 lại thành phân đoạn Aa1.6. Các lọ
44
đoạn Aa7.17. Đem các phân đoạn Aa1.6 và Aa7.17 đi đo GC/ MS. Phân đoạn Aa18 đến Aa20 còn lại chấm bản mỏng chưa được khả thi lắm nên chưa được nghiên cứu.
2.9. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureu tại Trung tâm chất lượng Nông Lâm Thuỷ sản vùng 2- NAFIQAD- 31 Ngũ Hành Sơn, Đà Nẵng.
2.9.1. Nguyên liệu
- Dịch chiết từ lá chùm ruột trong các dung môi ethanol, methanol và ethyl acetate. Ngâm trong vòng 1 tuần, lắc đều, sau đó đem lọc và cho bay hơi tự nhiên).
- Một số chủng vi sinh vật kiểm định.
Kiểm định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh:
- Vi khuẩn Gram (-): E. coli. (thời gian sinh trưởng 18 - 24h, ở nhiệt độ: 370C).
- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus. (thời gian sinh trưởng 16 - 24h, ở nhiệt độ: 370C).
2.9.2. Hóa chất
Môi trường BHI (nuôi cấy E. coli, Staphylococcus aureus): Beef heart
infusion (dịch cô tim bò) 250g; Calf brain infusion (dịch cô não bê) 200g; Proteose peptone 10g; NaCl 5g; Na2HPO4.12H2O 2,5g; Glucose 2g, pH 7,4.
Môi trường Hansen (nấm men): Glucose 50g; peptone 10g; KH2PO4 3g; MgSO4.7H2O 3g; agar (thạch) 20g; nước cất 1000ml; pH= 6,0.
45 2.9.3. Dụng cụ - Pipet. - Đèn cồn. - Đĩa petri. - Ống đục lỗ. - Ống nghiệm. - Cốc thủy tinh. - Que cấy, que gắp.
- Bông không thấm nước.
- Tủủ, tủ lạnh. - Cân phân tích. - Dụng cụ chiết. - Đũa thủy tinh. - Tủ cấy vi sinh. - Máy quang phổ. - Thước đo cm, mm. - Giá đểống nghiệm. 2.9.4.Phương pháp
Nguyên tắc: Ức chế tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị bằng dịch chiết từ
lá chùm ruột. Kiểm tra bằng khả năng khuếch tán qua giếng thạch.
Nuôi cấy vi sinh vật chỉ thịđể tăng sinh khối
Mọi thao tác được tiến hành sau khi đã khử trùng dụng cụ, tủ cấy và
được thực hiện bên trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn.
- Lấy sinh khối vi sinh vật chỉ thị cấy chuyền vào ống nghiệm chứa dung dịch peptone water (nước để tăng sinh khối cho vi khuẩn).
- Ủ hiếu khí với nhiệt độ và thời gian phù hợp với từng chủng VSV (Escherichia coli 37oC, 18 ÷ 24 giờ; Staphylococcus aureus 37oC, 16 ÷ 24 giờ).
Cách thực hiện:
- Trên môi trường agar trải VSV chỉ thị vào.
- Dùng ống nhôm đục hai lỗ trên thạch đường kính 8 mm.
- Lấy 0,1ml dịch chiết lá chùm ruột cho vào một lỗ, còn một lỗ cho vào 1 ml nước cất để làm đối chứng.
46
- Cho vào tủ lạnh 4oC trong thời gian 5 ÷ 6 giờ để cho dịch chiết khuếch tán ra môi trường.
- Ủ hiếu khí trong tủấm với nhiệt độ và thời gian phù hợp với từng VSV (Escherichia coli 37oC, 18 ÷ 24 giờ; Staphylococcus aureus 37oC, 16 ÷ 24 giờ).
- Quá trình đục lỗ: tất cả quá trình thực hiện bên trong tủ cấy vô trùng, mở nắp đĩa petri, dùng ống nhôm đường kính 8 mm khử trùng trên ngọn lửa
47
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.1.1. Độẩm
Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu lá chùm ruột được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1.Kết quả xác định độ ẩm của bột lá chùm ruột STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) Độẩm(%) 1 35.069 5.009 39.590 9.742 2 39.007 5.010 43.498 10.359 3 35.477 5.004 40.019 9.232 Độẩm trung bình 9.778 Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của bột lá chùm ruột khô là 9.778%, đây là độ ẩm tương đối an toàn. Với độ ẩm này, bột lá chùm ruột khô có thể giữ được chất lượng tốt khi bảo quản trong thời gian dài mà không bị ẩm mốc, đảm bảo yêu cầu cho bột dược liệu.
3.1.2. Hàm lượng tro
Lấy 3 mẫu đã xác định độ ẩm ở trên để xác định hàm lượng tro. Hàm lượng tro được lấy trung bình từ 3 mẫu trên. Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá chùm ruột được trình bày ở bảng 3.2.
48 Bảng 3.2.Kết quả xác định hàm lượng tro của lá chùm ruột STT m0 (g) m1(g) m3(g) Tro (%) 1 35.069 5.009 35.398 6.568 2 39.007 5.010 39.311 6.068 3 35.477 5.004 35.804 6.535
Hàm lượng tro trung bình 6.390
Nhận xét:
Vậy hàm lượng tro trung bình là 6.390%. Từ bảng trên ta thấy, trong lá chùm ruột có chứa hàm lượng lớn chất hữu cơ và một lượng rất nhỏ các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt các hợp chất phức của một số kim loại.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng một số kim loại trong lá chùm ruột được xác định bằng phương pháp đo AAS. Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.3.
Bảng 3.3.Hàm lượng kim loại trong lá chùm ruột
STT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 6193:1996 0.090610 0.044327 2 2 Cu TCVN 6193:1996 1.942611 0.097498 30 3 As TCVN 6826:2000 0.000214 0.000010 1 Nhận xét:
Hàm lượng kim loại Pb, Cu, As có trong lá chùm ruột là rất thấp. Đây là một trong những chỉ số quan trọng đểđánh giá việc sử dụng lá chùm ruột làm
49
dược liệu là an toàn, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho thực phẩm (theo quyết
định của bộ y tế số 505/BHT – QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô,tôi nhận thấy hàm lượng kim loại nặng có trong lá chùm ruột thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Do vậy có thể dử dụng an toàn lá chùm ruột trong dược liệu, không
ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ
HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT SOXHLET KHÁC NHAU TỪ
LÁ CHÙM RUỘT
Chiết soxhlet với các dung môi hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol bằng cách sử dụng nồi cách thủy và thu được 4 dịch chiết tương ứng với dung môi chiết.