5. Bốc ục luận vă n
2.6. ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT TỪ LÁ CHÙM RUỘT CHO QUÁ TRÌNH
PHÂN LẬP BẰNG SẮC KÝ
Cân 1kg mẫu lá chùm ruột đã được xử lý. Ngâm mẫu trong 3 lít methanol trong 7 ngày, tiến hành ngâm liên tục 3 lần như vậy. Dịch chiết sau 3 lần gộp lại tiến hành chưng ninh thu được cao methanol là phần cặn tương
đối sệt. Hòa tan cao methanol trong nước cất, cho vào phễu chiết 1 lít. Tiến hành chiết lỏng - lỏng liên tục với hexane để loại chất béo và diệp lục tố. Huyền phù còn lại chiết lỏng lỏng với ethyl acetate, thu được cao ethyl acetate rồi đem cao ethyl acetate đi phân lập.
32
Hình 2.11. Các cao chiết hexane, ethyl acetate và methanol
2.7. KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG [6], [28]
Phương pháp này được Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi.
2.7.1. Nguyên tắc
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và
đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng
đồng nhất và được cốđịnh trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy
định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha
động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
33
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/ b
Trong đó:
a : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu.
b : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng
đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên. Nó cũng
được các nhà hóa học tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được trong phản ứng.
Nhược điểm của kỹ thuật:
- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển. - Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi.
- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn.
2.7.2. Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử Dụng cụ - Tủ hút hơi độc. - Ðèn tử ngoại. - Máy ảnh. - Máy sấy. - Bản mỏng.
34
- Dụng cụđể phun thuốc thử.
- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín. - Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20 ml, và các ống mao quản.
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuric): Cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1,2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi khuấy được cho vào bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín.
Chuẩn bị bình triển khai
Bình triển khai dạng hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Dùng một mặt kính
đồng hồđậy kín bình triển khai để dung môi không bị bay hơi trong quá trình giải ly.
35
Chuẩn bị bản mỏng chạy sắc ký
Bản mỏng đã được tráng silicagel có kích thước 20x20 cm. Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 1x10 cm. Dùng bút chì mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1cm, mức tiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 0,5cm.
Chuẩn bị dịch chiết chạy sắc ký
Hòa tan 1 lượng nhỏ cao chiết ethyl acetatetrong dung môi ethyl acetate, sao cho cao tan tốt lại trong dung môi.
2.7.3. Cách tiến hành
Lựa chọn dung môi giải ly
Chọn dung môi triển khai tùy thuộc vào mẫu cần tách. Với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ không phân cực đến phân cực.
Chấm bản mỏng và sử dụng bình triển khai
Cho dung môi giải ly vào bình sao cho lớp dung môi dày khoảng 0,5 - 0,7 cm, để yên 5 - 10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình (nhờ tờ giấy lọc).
Dùng vi mao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dịch chiết ethyl acetate từ
lá chùm ruột, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn chứa dung dịch lên trên bản mỏng tại một điểm cách bản 1cm (điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).
Lưu ý: Chạm nhẹ vi quản vào bề mặt bản mỏng để không nhìn thấy lỗ
trên bề mặt và chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ (vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ
lan to). Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần nữa để có vết
36
một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm.
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào dung môi trong bình. Khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm.
Đậy nắp bình triển khai, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực hút mao dẫn. Theo dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung môi đã được vạch sẵn trước đó (cách đầu bản 0,5 cm) thì lấy bản ra khỏi bình, sấy khô bản bằng máy sấy.
2.7.4. Cách hiện hình vết sắc ký để xác định Rf
Tiến hành việc làm hiện hình vết sắc ký bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý. Quan sát trong buồng soi UV dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 365nm hoặc nhúng, phun xịt dung dịch thuốc thử hiện màu có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường và sấy khô bằng máy sấy trong 4 - 5 phút.
Nhận xét về màu sắc: Từ giá trị Rf của các vết thu được, chọn hệ dung môi khai triển là hệ dung môi cho các vết tách riêng biệt rõ ràng.
37
Hình 2.13. Buồng soi UV dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 365nm
2.8. SẮC KÝ CỘT [6]
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách
đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường.
2.8.1. Lựa chọn dung môi
Chọn dung môi hexane không phân cực để ổn định cột. Cho bản mỏng chạy trên hệ dung môi đơn từ không phân cực đến phân cực như hexane, ethyl acetate, methanol…thì thấy hexane cho các vết sát nhau, độ cao ở khoảng giữa của bản mỏng, ethyl acetate cho các vết kéo xa nhau và nhìn rõ ràng hơn, còn methanol thì kéo các vết lên nằm sát gần nhau về phía mức tuyền tuyến của bản mỏng. Trên cơ sở hệ dung môi đơn đó, tổng hợp và chọn tỉ lệ hệ dung môi hexane: ethyl acetate được trình bày dựa trên kết quả sắc ký bản mỏng:
38
Hình 2.14. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi hexane: ethyl acetate theo các tỉ lệ 3:7, 2:8 và 1:9 soi dưới đèn UV tại bước sóng 365nm
Nhận xét:
- Với hệ dung môi 1:9 các cấu tử tách ra khá rõ.
- Với hệ dung môi 2:8 các cấu tử tách ra không rõ, có hiện tượng kéo
đuôi.
- Với hệ dung môi 3:7 các cấu tử tách ra kém.
Do đó tôi chọn hệ dung môi hexane: ethyl acetate = 3: 7 làm hệ dung môi khởi đầu, sau đó tăng độ phân cực cho tới hệ dung môi hexane: ethyl acetat = 1: 9 và được trình bày ởở bảng sau:
Bảng 2.2. Một số tỉ lệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng
Dung môi ổn định cột Hệ dung môi Tỉ lệ
hexane: ethyl acetate 1: 9
hexane: ethyl acetate 2: 8
hexane
39
2.8.2. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột Chuẩn bị
Sử dụng cột sắc kí có đường kính d=3,5cm và chiều cao làm việc của cột là 40 cm của Hoa Kỳ. Lấy cốc 500ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ khoảng 130 gam silicagel đã sấy ở 130oC trong vòng 10 tiếng vào và khuấy
đều đặn đểđuổi hết bọt khí. Chú ý, không rót trực tiếp dung môi vào chất hấp thu (silicagel) bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 tiếng hoặc qua đêm để silicagel trương nở hết trong hexane. Trước khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane: silicagel, nếu hỗn hợp không có dạng sệt thì thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt, như
vậy khi nhồi cột hỗn hợp mới có thể rót chảy xuống cột dễ dàng. Dùng kẹp để
giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nới lỏng kẹp để có thể xoay cột theo vòng tròn, không nới kẹp rộng quá để tránh trường hợp cột không được giữ cốđịnh có khả năng rơi vỡ. Cho mẫu bông nhỏ vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Cách tiến hành
Dùng một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, cho vào cột 1 lượng hexane (có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane: silicagel đã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua bông gòn, giúp cốđịnh bông gòn ở bên dưới cột không bị
lệch khỏi đáy cột trong lúc cho hỗn hợp hexane: silicagel vào. Mở nhẹ khóa ở
bên dưới cột và dùng lọ thủy tinh hứng hexane chảy ra bên dưới cột. Khi bông gòn đã được cốđịnh, ta vặn khóa lại và chú ý trong cột bây giờ vẫn còn dung dịch hexane cao khoảng 30cm so với chiều cao làm việc của cột. Đổ nhẹ
40
cột theo vòng tròn và dùng một thanh cao su gõ nhẹ quanh thành cột từ dưới lên trên để chất hấp thu nén đều trong cột và không bị lỏng. Tiến hành mở nhẹ
khóa ở bên dưới cột để dung môi hexane tiếp tục chảy ra từ từ và hứng vào một lọ thủy tinh trống đểở bên dưới cột, hexane sau khi hứng lại được rót vào
đầu cột sắc ký. Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành liên tục như vậy cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột được chặt chẽ, cho thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Ta phải làm cho mặt thoáng chất hấp thu (silicagel) ởđầu cột nằm ngang. Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo trộn một phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đó để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng. Để ổn định cột qua đêm nhằm tránh tình trạng trạng nứt cột.
2.8.3. Nạp mẫu vào cột ở dạng khô
Cao chiết ethyl acetate được làm bay hơi dung môi, cân, sau đó cho lượng silicagel vừa đủ vào rồi đem đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều silicagel ra, nghiền thành bột mịn bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi hexane vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã gắn đều mẫu được thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục. Phủ lên trên mẫu 1 lớp silicagel mỏng nữa và cho 1 ít dung môi hexane ở trên đầu cột, để cột ổn định qua 3 tiếng.
2.8.4. Chạy cột tổng silicagel
Cột tổng chạy trên cao ethyl acetate (5,113 g) với hệ dung môi rửa giải hexane: ethyl acetate tăng dần độ phân cực (hệ dung môi ban đầu hexane:
41
EtOAc = 30:70), tốc độ hứng 10÷12 giọt/ phút. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ nhỏ 15ml.
Hình 2.15. Cột sắc ký và các lọ dung dịch hứng 15ml