5. Bố cục luận văn
1.3.1.Định nghĩa enzyme cố định
Enzyme cố định là những enzyme bị giữ, hoặc đƣợc cố định trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thƣờng, vẫn giữ đƣợc hoạt động xúc tác, có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần. Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme đƣợc gọi là chất mang hay giá thể [38].
1.3.2. Ưu – nhược điểm của enzyme cố định
a. Ưu điểm
- Có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lƣợng enzyme xác định. - Dễ dàng thực hiện quá trình phản ứng liên tục.
- Mở rộng giới hạn pH và nhiệt độ hoạt động. Trong trƣờng hợp phản ứng đƣợc xúc tác bởi hỗn hợp các enzyme, vẫn có thể tìm đƣợc điều kiện pH phù hợp để các enzyme đều có thể hoạt động tốt.
- Dễ dàng ngừng phản ứng một cách đơn giản bằng cách tách loại enzyme khỏi hỗn hợp phản ứng mà không cần sử dụng các yếu tố hóa lý nào khác.
b. Nhược điểm
- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme. - Hoạt tính của enzyme có thể bị giảm sau khi thực hiện việc cố định.
Tuy nhiên, những hạn chế trên không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme cố định mang lại. Vì vậy, ngày càng nhiều nghiên cứu về cố định enzyme làm xúc tác cho các phản ứng hóa học thay cho việc dung xúc tác vô cơ / hữu cơ truyền thống.
1.3.3. Tính chất của chế phẩm enzyme cố định
Khienzyme đƣợc cố định trên chất mang, hoạt động của nó bị giới hạn trong một vi môi trƣờng nhất định, nên có những tính chất khác hơn so với khi ở dạng tự do trong dung dịch (dạng hòa tan). Tính chất của enzyme không tan còn phụ thuộc vào phƣơng pháp cố định và bản chất của chất mang [38]. Cụ thể nhƣ sau:
a. Hoạt độ riêng (số đơn vị hoạt động tính trên mg hay g protein enzyme) Hoạt độ riêng của enzyme cố định thấp hơn ở dạng hòa tan, có thể do:
các mắt lƣới của gel, hay bị bọc trong các capsule;
- Bị thay đổi cấu trúc không gian sau khi kết hợp với chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, hoặc tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme;
- Bị kìm hãm hoặc bị biến tính một phần dƣới tác dụng của một số yếu tố khác nhau trong quá trình cố định enzyme.
b. Hằng số Km
Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo phƣơng trình Michaelis–Menten, nhƣng hằng số Km biểu kiến có thể thay đổi do:
- Ảnh hƣởng trƣờng tĩnh điện của chất mang;
- Sự khuếch tán của cơ chất đến enzyme, có thể không đồng đều giữa lớp gần chất mang và lớp xa chất mang;
- Sự khuếch tán của sản phẩm, đặc biệt đối với các enzyme nhạy với sự kìm hãm của sản phẩm.
Do nhiều nguyên nhân đã nêu, Km biểu kiến của enzyme không tan thƣờng cao hơn của ở dạng hòa tan
c. Độ bền của enzyme cố định
Độ bền của enzyme có thể không thay đổi hoặc tăng lên sau khi cố định. Trong nhiều trƣờng hợp, độ bền của enzyme cố định thƣờng lớn hơn khi ở dạng hòa tan [38].
pH thích hợp cho hoạt động của enzyme có thể thay đổi, nhất là đối với các cơ chất mang điện tích. Giá trị pH tối ƣu của enzyme cố định có thể thay đổi đến 2 đơn vị so với enzyme tự do [38].
Nhiệt độ hoạt động của enzyme cố định đƣợc mở rộng so với enzyme tự do, có thể lên đến trên 45oC.
1.3.4. Phương pháp cố định enzyme
Enzyme đƣợc gắn với giá thể bằng cách hấp phụ vật lý trên bề mặt giá thể (hình 1.15). Phƣơng pháp này dễ thực hiện nhất cho việc cố định enzyme và thƣờng ít ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzyme. Tuy nhiên, enzyme cũng dễ bị rửa trôi trong quá trình phản ứng và tái sử dụng nhiều lần. Mức độ giữ enzyme trên chất mang phụ thuộc nhiều vào pH, lực ion. Khi muốn tách enzyme ra khỏi chất mang có thể sử dụng dung dịch có lực ion lớn [29]. Các giá thể đƣợc dùng để hấp phụ có dung tích hấp phụ lớn nhƣ:
- Cellulose và các dẫn xuất của nó nhƣ diethylaminoethyl hoặc carboxymethyl (CM) cellulose [29].
- Dextran và các dẫn xuất dextran: DEAE- và CM-dextran [29]. - Hydroxyllapatile, calcium phosphate [29].
Hình 1.15. Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ [29] b. Bọc enzyme trong các nang
Phƣơng pháp bọc enzyme trong nang đƣợc thực hiện bằng cách bao bọc các enzyme trong màng bán thấm, tƣơng tự nhƣ giữ enzyme trong gel nhƣng bị hạn chế trong không gian (hình 1.16). Các phân tử enzyme có kích thƣớc lớn không thể thoát ra ngoài màng nang, nhƣng các cơ chất và sản phẩm của phản ứng nhỏ có thể đi qua màng [30]. Những vật liệu đã đƣợc sử dụng để chế tạo các viên nang có đƣờng kính từ 10 - 100 m nhƣ nylon và cellulose nitrate. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lƣới hình 1.17 nên cấu trúc của enzyme không bị biến đổi nhiều. Kích thƣớc của lƣới gel phải đƣợc kiểm soát để đảm bảo cấu trúc này đủ bé để ngăn cản enzyme thoát ra ngoài khi sử dụng, nhƣng cũng phải đủ lớn để cơ chất có thể khuếch tán vào đến enzyme; sản phẩm đƣợc tạo thành có thể khuếch tán ra khỏi mắt lƣới [29].
Các chất có thể tạo gel trong phƣơng pháp này là các chất có cấu tạo mắt lƣới nhƣ: gelatin, alginate, agarose, polyacryaminde hoặc các polymer tổng hợp.
Hình 1.17. Giữ enzyme trong gel [29] d. Tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme
Phƣơng pháp này hoàn toàn không dùng chất mang, mà dùng các chất có hai nhóm chức để tạo liên kết chéo với các phân tử enzyme, “khâu” các phân tử enzyme lại với nhau thành các phân tử có kích thƣớc lớn hơn, không tan và có thể tách khỏi hỗn hợp bằng cách ly tâm hoặc lọc [29]. Các chất thƣờng đƣợc dùng vào mục đích này là glutaraldehyde và một số chất khác nhƣ dimethyl suberimidate, phản ứng với nhóm amine; hoặc một số chất phản ứng với nhóm carboxyl, nhóm thiol. Trong số đó, glutaraldehyde đƣợc dùng phổ biến nhất [29]. Phƣơng pháp tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme đƣợc mô tả ở hình 1.18.
e. Gắn enzyme vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hoá trị
Phƣơng pháp cố định này liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa enzyme và chất mang nhƣ ở hình 1.19. Các liên kết cộng hoá trị sẽ tạo liên kết chặt giữa enzyme với chất mang so với các phƣơng pháp cố định khác, vì vậy có thể làm giảm sự thất thoát enzyme sau các quá trình xúc tác [29].
Các liên kết cộng hoá trị đƣợc hình thành giữa các nhóm chức trên bề mặt chất mang và các nhóm chức của enzyme (các nhóm amin, carboxyl và cả nhóm thiol) [29].
Hình 1.19. Cố định enzyme bằng liên kết cộng hoá trị [29]
Bảng 1.2. Các phương pháp cố định enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hoá trị
Gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng trị thƣờng qua 2 giai đoạn chính:
- Xử lý, hoạt hoá chất mang trƣớc khi gắn enzyme. - Gắn enzyme vào chất mang đã đƣợc hoạt hoá.
Một số phƣơng pháp thƣờng đƣợc dùng để hoạt hoá chất mang nhƣ: cyanogen, bromide, diazot hoá, azide acid, các chất ngƣng tụ,... đƣợc thể hiện ở bảng 1.2.
Phản ứng Liên kết giữa enzyme và chất mang
Diazot hoá Giá thể --N=N---enzyme
Ankyl hoá và acryl hoá Giá thể--CH2-NH---enzyme
Giá thể--CH2-S---enzyme
Hình thành phức Schiff's base Giá thể--CH=CN---enzyme
Tạo liên kết peptide Giá thể--CO-NH---enzyme
Phản ứng amide Giá thể--CNH-NH---enzyme
tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất, từ đó nâng cao hiệu suất của quá trình chuyển hóa. Hai phƣơng pháp phổ biến có thể đƣợc sử dụng để cố định enzyme trên vật liệu nano là cố định bằng lực hấp phụ vật lý và cố định bằng liên kết cộng hóa trị.
Cố định bằng kết cộng hoá trị thƣờng đƣợc sử dụng để gắn chặt enzyme trên bề mặt các hạt nano, tránh sự bóc tách trong suốt quá trình phản ứng dƣới điều kiện khuấy trộn cơ học. Hình 1.20 mô tả các phƣơng pháp cố định enzyme lên các hạt nano bằng liên kết cộng hóa trị thông qua chức năng hóa bề mặt vật liệu nano.
Hình 1.20. Cố định enzyme lên các hạt nano bằng liên kết cộng hoá trị [34]
1.3.6. Cố định enzyme lên các hạt nano oxit sắt từ
Việc cố định enzyme lên bề mặt vật liệu Fe3O4NP có nhiều ƣu điểm hơn so với các vật liệu khác do:
- Tính tƣơng thích sinh học của hạt Fe3O4NP: đảm bảo hiệu quả kết dính, độ bền và duy trì hoạt tính của chế phẩm enzyme;
- Diện tích bề mặt của Fe3O4NP lớn: tăng cƣờng khả năng chất chứa enzyme và cải thiện khả năng tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất;
- Tính ƣa nƣớc của Fe3O4NP: tƣơng thích sinh học tốt, dễ dàng chức năng hóa bề mặt với các nhóm chức khác nhau, giúp cho việc cố định các phân tử enzyme khác nhau bằng liên liên kết cộng hoá trị.
- Tính chất siêu thuận từ: cho phép tách các enzyme đƣợc cố định bằng từ trƣờng ngoài và tái sử dụng có hiệu quả [34].
1.3.7. Cố định enzyme Lipase trên các hạt Fe3O4NP
Nhƣ đã nói ở trên, lipase là một trong những enzyme phổ biến đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Để có thể triển khai ứng dụng trong quy mô sản xuất công nghiệp, cần phải có giải pháp để mở rộng giới hạn bền của xúc tác lipase, cũng nhƣ tái sử dụng chúng có hiệu quả. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong kỹ thuật cố định enzyme có thể đƣợc kể đến là phƣơng pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, lồng nhốt và tạo liên kết chéo trên bề mặt vật liệu Fe3O4NP. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu công bố liên quan đến việc cố định lipase trên vật liệu nano. Mak và cộng sự đã tiến hành cố định enzyme Pseudomonas cepacia lipase lên bề mặt Fe3O4NP thông qua sự hoạt hóa bằng tác nhân carbodiimide. Hiệu suất cố định là 90% khi tỉ lệ khối lƣợng lipase và hạt nano là 0,09. Điều kiện hoạt động tối ƣu về nhiệt độ và pH của enzyme cố định đƣợc công bố là tƣơng tự nhƣ enzyme tự do, tuy nhiên độ bền nhiệt của enzyme cố định đƣợc nâng cao đáng kể và dễ dàng thu hồi enzyme cố định sau phản ứng bằng từ trƣờng ngoài. Nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng sản phẩm enzyme cố định thu đƣợc rất phù hợp để làm xúc tác cho phản ứng este chéo hóa dầu thực vật sản xuất biodiesel [16].
Ngoài ra, cũng có công trình nghiên cứu cố định enzyme Mucor javanicus lipase bằng cách tạo liên kết ngang trên bề mặt vật liệu Fe3O4NP để làm chất xúc tác cho phản ứng tổng hợp 1,3-diacylglycerols. Hệ enzyme này có giá thành rẻ, có thể tái sử dụng trong 10 chu kỳ lặp đi lặp lại ở nhiệt độ 550 C mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu [35].
hóa dầu đậu nành. Hoạt tính xúc tác của sản phẩm enzyme cố định thu đƣợc là cao và duy trì ổn định 4 chu kì liên tục [21].
Thay vì sử dụng một loại enzyme lipase, cố định hai loại lipase với đặc tính bổ sung cho nhau trên cùng một chất mang là cách tiếp cận hiệu quả về chi phí trong sản xuất biodiesel . Lipase từ Rhizopus orizae và Candida rugosa đƣợc cố định lên silica bằng liên kết cộng hóa trị đƣợc sử dụng để sản xuất biodiesel từ dầu canola thô. Trong điều kiện tối ƣu, tỷ lệ chuyển đổi dầu canola đã khử gum thành methyl este của axit béo là 88,9%, cao hơn so với chuyển đổi thu đƣợc bằng hỗn hợp enzyme tự do (84,25%) [21].
1.4. Chế tạo Biodiesel thông qua phản ứng ester chéo hóa dầu thực vật xúc tác bởi enzyme cố định Lipase bởi enzyme cố định Lipase
1.4.1. Biodiesel và công nghệ chế tạo
a. Giới thiệu biodiesel
Theo định nghĩa về hóa học, biodiesel là hỗn hợp các methyl este của các axít béo. Đây một loại nhiên liệu có tính chất tƣơng đƣơng với nhiên liệu dầu diesel nhƣng không phải đƣợc sản xuất từ dầu mỏ mà từ dầu thực vật hay mỡ động vật. Có 3 con đƣờng phổ biến để chuyển hóa dầu, mỡ động thực vật tạo thành biodiesel, bao gồm:
- Thực hiện ester chéo hóa dầu/mỡ xúc tác kiềm; - Thực hiện este rchéo hóa dầu/mỡ xúc tác axit;
- Chuyển hóa dầu thành các axit béo của nó, sau đó tạo thành biodiesel. Phƣơng pháp phổ biến hiện nay là dùng xúc tác kiềm để điều chế biodiesel do điều kiện thực hiện phản ứng êm dịu ở nhiệt độ và áp suất thấp, hiệu suất chuyển hóa lên đến 98%. Tuy nhiên, việc sử dụng xúc tác kiềm cũng bộc lộ nhiều yếu điểm, đặc biệt là hiện tƣợng tạo muối của axit béo, gây ra hiện tƣợng tạo nhũ khó tách. Do yếu điểm này mà ngày nay, ngƣời ta có xu hƣớng nghiên cứu sử dụng xúc tác enzyme lipase thay cho xúc tác kiềm.
Phản ứng este chéo hóa xảy ra nhƣ sau:
Theo định nghĩa kỹ thuật (ASTM D 6751), biodiesel đƣợc định nghĩa và phân loại nhƣ sau:
Biodiesel, n – nhiên liệu bao gồm các este mono alkyl của axit béo mạch dài có nguồn gốc từ dầu thực vật hoặc mỡ động vật, đƣợc chỉ định là B100, và đáp ứng các yêu cầu của ASTM D 6751;
Biodiesel Blend, n – hỗn hợp nhiên liệu sinh học đáp ứng tiêu chuẩn ASTM D 6751 với dầu diesel dựa trên dầu mỏ, đƣợc chỉ định là BXX, trong đó XX đại diện cho tỷ lệ thể tích của nhiên liệu diesel sinh học trong hỗn hợp này.
b. Ưu, nhược điểm biodiesel
* Ƣu điểm
Hiện nay, trên khắp thế giới, các chính sách và chiến lƣợc phát triển nhiên liệu sinh học của nhiều quốc gia đang đƣợc thực thi ở những mức độ và quy mô khác nhau.
Về mặt môi trường
Giảm lƣợng khí thải CO2, do đó giảm lƣợng khí thải gây ra hiệu ứng nhà kính.
Không có hoặc chứa rất ít các hợp chất của lƣu huỳnh (<0,001% so với trong dầu Diesel đến 0,2%). Hàm lƣợng các hợp chất khác trong khói thải nhƣ: CO, SOx, hidrocacbon chƣa cháy, bồ hóng giảm đi đáng kể nên có lợi rất lớn đến môi trƣờng và sức khoẻ con ngƣời.
Giảm sự tiêu dùng các sản phẩm dầu mỏ.
Về mặt kỹ thuật
Biodiesel rất linh động có thể trộn với diesel theo bất kì tỉ lệ nào.
Biodiesel có điểm chớp cháy cao hơn diesel, đốt cháy hoàn toàn, an toàn trong tồn chứa và sử dụng.
Trong thành phần của biodiesel có chứa oxi. Cũng giống nhƣ S, O có tác dụng giảm ma sát nên biodiesel có tính bôi trơn tốt.
Do có tính năng tƣợng tự nhƣ dầu Ddesel nên nhìn chung khi sử dụng không cần cải thiện bất kì chi tiết nào của động cơ.
Về mặt kinh tế
Sử dụng nhiên liệu biodiesel ngoài vấn đề giải quyết ô nhiễm môi trƣờng nó còn thúc đẩy ngành nông nghiệp phát triển, tận dụng tiềm năng sẵn có của ngành nông nghiệp nhƣ dầu phế thải, mỡ động vật, các loại dầu khác ít có giá trị sử dụng trong thực phẩm.
Hạn chế nhập khẩu nhiên liệu diesel, góp phần tiết kiệm cho quốc gia một khoảng ngoại tệ lớn.
* Nhược điểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Biodiesel có nhiệt độ đông đặc cao hơn diesel nên gây khó khăn khi sử dụng ở các nƣớc có nhiệt độ vào mùa đông thấp.
- Biodiesel có nhiệt trị thấp hơn so với diesel nên động cơ sẽ không bốc khi tăng tốc.
- Biodiesel dễ bị ôxy hóa do đặc điểm thành phần hóa học. Do đó, khó có thể tích trữ loại nhiên liệu này lâu, cần phải có thêm các chất phụ gia để giữ nhiên liệu đƣợc lâu hơn.
- Chi phí sản suất cao, tuy nhiên với sự cạn kiệt dần nguồn tài nguyên dầu mỏ, sự leo thang giá cả nhiêu liệu nhƣ hiện nay thì vấn đề này không còn là rào cản.