Phương pháp nghieđn cứu

1. 2G iới thieơu các dược lieơu nghieđn cứu

2.5 Phương pháp nghieđn cứu

2.5.1 Nghieđn cứu veă thực vaơt

2.5.1.1 Mođ tạ đeơ định danh

- Caín cứ vào các tài lieơu mođ tạ đaịc đieơm hình thái thực vaơt cụa cađy đeơ đôi

chiêu và sơ boơ xác định loài cađy khạo sát.

- Mău cađy được sơ boơ định danh theo teđn địa phương.

- Kieơm tra lái teđn khoa hĩc tương ứng với các khóa tra trong tài lieơu.

- Tham khạo ý kiên cụa các chuyeđn gia veă thực vaơt đeơ xác nhaơn lái teđn khoa

hĩc cụa cađy .

2.5.1.2 Giại phău hĩc

- Chĩn mău: mău tieđu bạn phại đái dieơn cho dược lieơu, lây mău khođng non hoaịc già quá. - Caĩt tieđu bạn: tieđu bạn được caĩt baỉng lưỡi lam hay máy caĩt caăm tay (microtome). Nhuoơm màu baỉng phương pháp nhuoơm kép (carmin-vert iod)[17], quan sát dưới kính hieơn vi. Kêt quạ theơ hieơn baỉng cách vẽ và chúp hình baỉng máy ạnh.

- Boơt soi: boơt soi có được baỉng cách lây cùng boơ phaơn dùng đeơ làm tieđu bạn vi

phău, caĩt nhỏ, sây ở 60  5oC, tán nhé và rađy qua rađy sô 32 (mịn), phaăn còn lái

được sây tiêp và rađy đên hêt. Boơt sẽ được quan sát baỉng nước hay dung dịch glycerin (TT) hoaịc sau khi nhuoơm kép baỉng phaơm nhuoơm tređn [17], [100].

2.5.2 Nghieđn cứu veă dược lý

Trong phaăn toơng quan có neđu moơt sô phác đoă đieău trị sỏi thaơn, ví dú Ngođ Gia Hy và coơng sự đã báo cáo veă tác dúng đieău trị sỏi nieơu quạn baỉng truyeăn dịch

ngĩt kêt hợp với khellin, hốt chât được chiêt từ cađy Ammis visnaga, có tác dúng

làm giãn cơ trơn giúp giạm đau và bài xuât sỏi [22]. Beơnh vieơn Y Hĩc Dađn Toơc tưnh Haơu Giang kêt hợp với trường Đái hĩc Caăn Thơ nghieđn cứu veă cađy Rau om trong chê phaơm Hoàn sán thaơn dùng trị beơnh sỏi thaơn, thuôc rât được nhađn dađn tín nhieơm [13]. Naím 2001, Dương Minh Sơn trong luaơn án tiên sĩ: “Nghieđn cứu tác dúng cụa bài thuôc Thách kim thang trong đieău trị sỏi nieơu quạn” đã nghieđn cứu bài thuôc với các vị như Kim tieăn thạo, Trách tạ, Rađu mèo, Keđ noơi kim, Uât kim và Hốt thách tređn 70 beơnh nhađn, kêt quạ 70,59% beơnh nhađn khỏi beơnh [16], [27]. Tác dúng cụa bài thuôc này chụ yêu dựa vào tính lợi tieơu và tính làm mòn sỏi ở những beơnh nhađn bị sỏi thaơn.

Qua kinh nghieơm dađn gian và các tài lieơu thu thaơp được đã cho thây vieơc đieău trị sỏi thaơn baỉng thuôc có nguoăn gôc tự nhieđn thường dựa vào các cơ chê như làm

mòn hoaịc tan sỏi, tông sỏi ra ngoài cơ theơ nhờ tác đoơng lợi tieơu hoaịc làm giãn cơ trơn giúp vieđn sỏi thoát ra ngoài deê dàng [7],[13],[14],[22],[27],[53],[106].

Veă maịt dược lý thực nghieơm, vieơc xađy dựng mođ hình táo ra sỏi tređn thú đeơ thử nghieơm trực tiêp là moơt vieơc khó khaín, do đó chúng tođi dựa vào mođ hình đieău trị sỏi thaơn theo các cơ chê tređn đeơ thử nghieơm cho các dược lieơu nghieđn cứu.

2.5.2.1 Thử nghieơm tác đoơng lợi tieơu

Tác đoơng lợi tieơu được thử nghieơm baỉng phương pháp Valette cại tiên[33].

Súc vaơt thử nghieơm:

- Sử dúng chuoơt công traĩng Mus wista, trĩng lượng P = 180 ± 20 g.

- Nuođi trong các chuoăng chuaơn (standard cages).

- Chuoơt được cho aín chê đoơ aín thí nghieơm và uông nước tự do.

- 24 giờ trước thử nghieơm chuoơt được chuyeơn sang các loăng biên dưỡng

(metabolic cages) chư được cho uông nước, khođng cho thức aín.

Dúng cú: loăng biên dưỡng đeơ giữ chuoơt và hứng nước tieơu trong thời gian thử nghieơm, bơm và kim tieđm, kim cho uông thuôc.

Mău thử nghieơm: Các boơt dược lieơu Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om laăn lượt được đem chiêt

xuât baỉng coăn 96% và coăn 60%. Bã dược lieơu

còn lái được chiêt tiêp baỉng coăn 20% (phađn đốn 7*) .

Gom 2 dịch coăn cao đoơ cụa moêi dược lieơu, lối táp, cođ thu hoăi dung mođi có được cao coăn. Cao coăn cụa moêi lối dược lieơu được đem chiêt laăn lượt (phađn bô lỏng-lỏng) với các dung mođi sau: ether daău hỏa (1), benzen (2), diclorometan (3), ether ethylic (4), ethyl acetat (5), n-butanol (6). Cođ thu hoăi dung mođi được các phađn đốn tương ứng.

Moơt sô mău được chĩn đeơ thử tác đoơng lợi tieơu goăm:

- CH (C1, Co, C7) KTT (K1, K2, K7) RO (R1, R2, R7)

- Chât tinh khiêt: M1 (Chuôi hoơt), Ds1, Ds2 (Kim tieăn thạo), L1, L2, L3 (Rau

om)

Ghi chú:

C1, K1, R1: phađn đốn ether daău hỏa cụa Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om

K2, R2 : phađn đốn benzen cụa Kim tieăn thạo và Rau om

C7, K7, R7 : phađn đốn coăn 20% cụa 3 dược lieơu tređn

Co : caĩn còn lái sau khi chiêt cao coăn Chuôi hoơt baỉng ether daău hỏa Các mău này có được từ dịch chiêt các phađn đốn dung mođi có đoơ phađn cực khác nhau neđn khó tan trong nước, chât dimethyl sulfoxid (DMSO) được chĩn làm chât trợ tan, giúp hòa tan mău.

Tiên hành thử nghieơm:

Chuoơt được phađn vào các lođ tương ứng: Lođ thử: 9 con/mău, chia làm 3 laăn thử, moêi laăn 3 con. Mău thử nghieơm: cao thử nghieơm + DMSO + nước cât.

Lođ chứng: DMSO + nước cât.

Theơ tích dung dịch đưa vào dá dày chuoơt cụa lođ thử và lođ chứng là 3ml / con. Lieău thử nghieơm được dò tìm tređn cơ sở lieău thođng thường dùng cho người và theo nguyeđn taĩc taíng daăn [5].

Moêi con chuoơt trong cạ hai lođ thử và lođ chứng đeău được tieđm dưới da 1ml/100g theơ trĩng dung dịch NaCl 0,9% khi thí nghieơm.

Chư tieđu theo dõi: đo theơ tích nước tieơu trong 6 giờ lieđn túc và sau 24 giờ sau

khi cho chuoơt uông nước hoaịc thuôc.

Tính kêt quạ: theo phương pháp Valette cại tiên Kêt quạ được theơ hieơn baỉng % lợi tieơu và chư sô T: % Lợi tieơu =

V V '

V

× 100 V’ : theơ tích trung bình cụa nước tieơu lođ thử

V : theơ tích trung bình cụa nước tieơu lođ chứng Chư sô T =

V '

V Nêu T > 1 : thuôc có hướng lợi tieơu

Nêu T < 1 : thuôc khođng có hướng lợi tieơu Kêt quạ còn được tính theo thông keđ, dùng test student đeơ xem xét sự khác bieơt giữa lođ thử và lođ chứng.

2.5.2.2 Thử nghieơm tác đoơng giãn cơ

Thử nghieơm tác đoơng giãn cơ được tiên hành tređn đốn ruoơt non cođ laơp, kêt quạ được bieơu thị baỉng cách so sánh bieđn đoơ và taăn sô co bóp cụa ruoơt khi tiêp xúc với dung dịch thử nghieơm và/với dung dịch chứng.

- Dung dịch Tyrode (dung dịch chứng)

dịch có hàm lượng 1 mg/60 ml.

- Hyoscin butylbromide (Buscopan) ông 20mg/ml (Boehringer-Ingelheim): pha thành dung dịch có hàm lượng 1 mg/60 ml.

Dung dịch Tyrode được dùng như dung dịch kieơm chứng, Histamin dihydrochloride hoaịc Hyoscin butylbromide dùng như chât kieơm tra và đôi chiêu.

- Mău thử: tương tự như nguyeđn lieơu dùng cho thử nghieơm lợi tieơu. Các mău

deê tan thì hòa trực tiêp và 5ml nước cât (C7, K7, R7). Các mău còn lái khó tan thì

hòa vào dung mođi goăm có nước cât và DMSO (dimethyl sulfoxid) với tư leơ 3:2

(ml/ml). Các chât tinh khiêt M1, Ds2, L1, L2, L3 được hòa vào cùng dung mođi như

tređn. Trước khi tiên hành thử nghieơm, tât cạ các dung dịch thử đeău được pha

loãng trong 60 ml nước cât ở 37oC theo các noăng đoơ sau: 0,20 ml; 0,40 ml; 0,60 ml;

0,80 ml.

- Súc vaơt thử nghieơm: tương tự như thử nghieơm lợi tieơu (Chuoơt công Mus wista).

Hình 2.5 A. Chuoơt được moê búng đeơ lây phaăn ruoơt dùng cho thử nghieơm B. Đốn

ruoơt cođ laơp được nhúng vào dung dịch nuođi (Tyrode)

Chuoơt được làm chêt thaơt nhanh baỉng cách kép khí quạn, moơ và caĩt lây đốn ruoơt non dài chừng 2,5 cm, rửa sách baỉng dịch nuođi (dung dịch Tyrode). Cho khúc ruoơt đã chuaơn bị vào trong ông nghieơm thụy tinh (3 x 11) cm, có chứa sẵn

60 ml dung dịch Tyrode được làm âm ở 37oC và luođn có luoăng khí oxy thoơi vào.

Moơt đaău khúc ruoơt được cô định bởi moơt móc thuỷ tinh ở đáy ông nghieơm, đaău

còn lái nôi với bút ghi và heơ thông trúc quay đeơ ghi lái bieđn đoơ (mm.phút-1), taăn

sô (sô laăn co bóp cụa ruoơt trong 1 phút) cụa ruoơt tređn bieơu đoă gaĩn với máy quay

Kymograph (tôc đoơ quay 1,5 vòng/ phút). Cuôi cùng so sánh kêt quạ sau nhieău

laăn thử nghieơm tređn các lieău khác nhau cụa moêi mău thử.

Bieđn đoơ co bóp và taăn sô co thaĩt cụa ruoơt được ghi nhaơn sau khi theđm dung dịch Histamin hay Buscopan (chât đôi chiêu) và dung dịch thử nghieơm với các noăng đoơ khác nhau. Moêi thử nghieơm sẽ được tiên hành 3 laăn ở cùng đieău kieơn.

Chú thích: Bieđn đoơ được tính baỉng mm (là giá trị trung bình đo trong 1 phút), taăn sô được tính theo chieău dài tređn baíng giây khaĩc ly, cứ đụ 20 ođ vuođng thì tương ứng với sô laăn co bóp cụa ruoơt trong 1 phút.

2.5.2.3 Thử nghieơm tính mòn sỏi [14]

- Mău sỏi: sỏi do khoa tiêt nieơu beơnh vieơn Bình Dađn (TPHCM) cung câp, được tiên sĩ Traăn Thanh Nhãn (Boơ mođn Sinh hoá-Đái hĩc Y Dược TP Hoă Chí Minh)

phađn lối là sỏi calci oxalat với các vieđn sỏi 2A, 2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 6A, 6B, 6C (các

đưnh đaịc trưng phoơ IR là 1618.2, 1315.4,781.1). Xemphú lúc (PL-1).

- Dung dịch thử: cao nước cụa dược lieơu (Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om) được chuaơn bị baỉng cách cađn 200 gam moêi dược lieơu, caĩt ngaĩn cho vào noăi, theđm nước vào nâu sođi trong 3 giờ, lĩc. Bã còn lái cho nước vào nâu tiêp, lĩc. Gom dịch lĩc lái và cođ tređn bêp đên dáng cao đaịc. Đaịc đieơm cụa các cao được trình bày trong Bạng 2.7.

Bạng 2.7 Đoơ aơm và hàm lượng (khođ tuyeơt đôi) cụa các cao nước từ các dược lieơu trong thử nghieơm tính mòn sỏi

Dược lieơu Chuôi hoơt Kim tieăn thạo Rau om

Đoơ aơm (%) 38 25 45

Hàm lượng cao/DL (%) 8,5 12 13,5

- Tiên hành: chuaơn bị sỏi, rửa sách, sây ở 50C đên khôi lượng khođng đoơi.

Cađn

noăng đoơ 1:1 và 1:10 cho moêi dược lieơu), cho sỏi vào. Đaịt côc vào máy đieău nhieơt ở 37C. - Cháy máy (đieău nhieơt) vào lúc 8 giờ sáng và laĩc côc theo quy định:

• Buoơi sáng: laĩc 4 laăn theo moơt thao tác (laĩc nhé qua lái) trong 1 phút. Giờ laĩc: 8: 30 ; 9:30 ; 10:30ø và 11:30 giờ.

• Buoơi chieău: laĩc 3 laăn như tređn

Giờ laĩc: 14:00 ; 15:00 ; và 16:00 giờ. Taĩt máy. - Ngày thứ 2 và thứ 3 tiên hành như ngày đaău.

- Ngày thứ 4: 8 giờ baơt máy và 9 giờ laĩc đeău như tređn trong 1 phút. Taĩt máy. - Rửùa sách các vieđn sỏi tređn baỉng nước sách, tráng lái baỉng nước cât. Sây vieđn

sỏi ở 50C đên khôi lượng khođng đoơi. Cađn lái khôi lượng vieđn sỏi.

Khôi lượng sỏi tan vào các dung dịch thử nghieơm là hieơu sô giữa khôi lượng cađn cụa vieđn sỏi trước và sau khi thử nghieơm.

Moêi vieđn sỏi thử nghieơm ở các noăng đoơ cao khác nhau sẽ được thử lieđn tiêp 3 đợt theo qui trình tređn.

2.5.2.4 Thử nghieơm tác đoơng kháng khuaơn

- Nguyeđn taĩc: dùng phương pháp pha loãng tređn mođi trường raĩn đeơ xác định noăng đoơ ức chê tôi thieơu (MIC) cụa các chât thử nghieơm [78].

* Mođi trường hốt hóa vi khuaơn thử nghieơm: Tryptic Soy Broth (TSB) * Mođi trường thử nghieơm : thách Mueller - Hinton agar (MHA) * Chuaơn đoơ đúc: sử dúng thang đoơ đúc Mc Farland 0,5

* Vi khuaơn thử nghieơm:Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus

aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853 và MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) [78 ].

- Mău thử: các dược lieơu Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om được chiêt xuât thành cao coăn. Rieđng Rau om còn dùng theđm tinh daău và nước ép tươi.

Bạng 2.8 Đaịc đieơm các cao dùng trong thử nghieơm tính kháng khuaơn

Đaịc đieơm cao dược lieơu Trĩng lượng cao (g) Tỷ leơ cao/DL (%) Đoơ aơm (%)

Chuôi hoơt 94,45 18,89 35

Kim tieăn thạo 28,68 5,7 28

2.5.2.5 Thử nghieơm đoơc tính câp dieên

Theo phương pháp Boơ Y tê Vieơt Nam ban hành (thođng tư 371) [5], [15]

- Nguyeđn lieơu: cao coăn tương tự như trong thử nghieơm tính kháng khuaơn. - Súc vaơt thử nghieơm: dùng chuoơt nhaĩt traĩng chụng Swiss albino, 5 tuaăn tuoơi,

P = 20  2 g/con do vieơn Pasteur TP Hoă Chí Minh cung câp, chuoơt được nuođi oơn

định ít nhât 1 tuaăn trước khi tiên hành thử nghieơm.

Tiên hành: chuoơt nhaĩt được chia thành nhieău nhóm tương tự nhau, những con ở cùng nhóm sẽ nhaơn cùng moơt lieău chât khạo sát. Sự đánh giá dựa vào phạn ứng toàn ứng hay bât ứng (sông hay chêt) nhaơn thây ở moêi thú thử nghieơm trong nhóm. Sau khi cho chuoơt uông thuôc (lieău duy nhât trong ngày), quan sát các hành vi, theơ tráng chuoơt sau 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Ghi nhaơn giờ xuât hieơn các trieơu chứng bât thường, giờ chêt. Nêu có chuoơt chêt thì tiên hành xét nghieơm đái theơ chụ

yêu gan, thaơn, tim, phoơi. Xác định LD50 (lieău làm chêt 50% súc vaơt thử).

2.5.3 Nghieđn cứu veă hoá hĩc

2.5.3.1 Xác định hàm lượng K+ trong Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om

Hàm lượng K+ có trong các dược lieơu được xác định baỉng phương pháp

quang kê ngĩn lửa (Lisabio PHF 90 D).

Nguyeđn taĩc: dược lieơu được đôt và nung thành tro. Hoà tan tro với nước cât, lĩc qua giây lĩc. Dịch lĩc này là mău thử và được phađn tích baỉng máy quang kê ngĩn lửa, kêt quạ so sánh với dung dịch KCl chuaơn.

Tiên hành:

- Chuaơn bị dung dịch chuaơn: cađn chính xác 1,5 g KCl (đã sây khođ ở 130oC/1

giờ), hoà tan với nước cât 2 laăn vừa đụ bình định mức 1000 ml. Lây chính xác 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, theđm nước vừa đụ. Đađy là dung

dịch chuaơn (20 mEq KCl).

- Chuaơn bị dung dịch thử: cađn chính xác 1 gam dược lieơu (moêi lối dược lieơu thực hieơn 3 mău), đôt và nung thành tro đên khôi lượng khođng đoơi. Hoà tan kỹ tro toàn phaăn này với nước cât 2 laăn. Lĩc qua giây lĩc vào bình định mức 10 ml. Các

dung dịch này được đem đi phađn tích baỉng phương pháp quang kê ngĩn lửa.

2.5.3.2 Chât chiêt được tan trong coăn: tiên hành theo Dược đieơn Vieơt Nam III.

Cađn chính xác khoạng 2 gam dược lieơu đã được xay mịn, cho vào bình tam giác 250 ml nút mài. Theđm chính xác 50 ml dung mođi là coăn 95%, đaơy nút, cađn chính xác đên 0,01 g. Laĩc đeău và đeơ yeđn trong 1 giờ. Laĩp sinh hàn hoăi lưu đun sođi nhé trong 1 giờ. Đeơ nguoơi và cađn đieău chưnh khôi lượng bình như khôi lượng ban đaău baỉng dung mođi. Laĩc đeău và lĩc nhanh qua giây lĩc khođng taơm dung mođi. Lây chính xác 25 ml dịch lĩc vào moơt becher 50 ml, cođ tređn cách thụy còn khoạng 5 ml, chuyeơn toàn boơ dịch này vào moơt chén kêt tinh đã được sây khođ đên khôi lượng khođng đoơi và cađn bì. Tiêp túc làm khođ dịch lĩc tređn cách thụy,

sau đó đem sây ở 100-105 °C trong 3 giờ. Đeơ nguoơi trong bình hút aơm, cađn.

Hàm lượng chât tan trong coăn được tính theo cođng thức:  h a b X    100 20000 %

a: khôi lượng dược lieơu (g) b : khôi lượng caĩn cađn được (g) h : đoơ aơm cụa dược lieơu (%)

2.5.3.3 Chiêt xuât và định lượng tinh daău [23]

Dùng phương pháp cât kéo theo hơi nước, sử dúng dúng cú Clevenger [4][23].

Tinh daău có được sẽ đem lối nước baỉng NaSO4 khan. Đeơ nơi mát tránh ánh sáng.

2.5.3.4 Sơ boơ khạo sát thành phaăn hóa hĩc

Áp dúng phương pháp cụa boơ mođn Dược Lieơu-Khoa Dược-Đái hĩc Y Dược TP Hoă Chí Minh (cại tiên từ phương pháp cụa trường Đái hĩc Dược khoa Rumani) [3]. Nguyeđn taĩc là dựa vào đoơ hòa tan cụa các hợp chât trong dược lieơu đeơ tách chúng baỉng dung mođi có đoơ phađn cực khác nhau. Sau đó xác định các hợp chât baỉng các phạn ứng chuyeđn bieơt.

2.5.3.5 Chiêt xuâtdược lieơu

Sử dúng phương pháp chiêt xuât ngược dòng laăn lượt với EtOH 96% và EtOH 60%. Hai dịch chiêt được goơp chung lái, lối táp, thu hoăi dung mođi được cao coăn. Cao coăn này được chiêt phađn đốn với các dung mođi có đoơ phađn cực taíng daăn (1. Ether daău hỏa, 2. Benzen, 3. Diclorometan, 4. Ether ethylic, 5. Ethyl acetat, 6.

n-butanol). Thu hoăi dung mođi ta được các phađn đốn tương ứng. Các phađn đốn này được đem thử nghieơm dược lý tređn 2 mođ hình lợi tieơu và

giãn cơ. Kêt quạ khạo sát có được, kêt hợp với tham khạo tài lieơu đeơ định hướng cho

các nghieđn cứu hoá hĩc kê tiêp.

2.5.3.6 Phađn laơp