1. 2G iới thieơu các dược lieơu nghieđn cứu
2.5.2 Nghieđn cứu veă dược lý
Trong phaăn toơng quan cĩ neđu moơt sơ phác đoă đieău trị sỏi thaơn, ví dú Ngođ Gia Hy và coơng sự đã báo cáo veă tác dúng đieău trị sỏi nieơu quạn baỉng truyeăn dịch
ngĩt kêt hợp với khellin, hốt chât được chiêt từ cađy Ammis visnaga, cĩ tác dúng
làm giãn cơ trơn giúp giạm đau và bài xuât sỏi [22]. Beơnh vieơn Y Hĩc Dađn Toơc tưnh Haơu Giang kêt hợp với trường Đái hĩc Caăn Thơ nghieđn cứu veă cađy Rau om trong chê phaơm Hồn sán thaơn dùng trị beơnh sỏi thaơn, thuơc rât được nhađn dađn tín nhieơm [13]. Naím 2001, Dương Minh Sơn trong luaơn án tiên sĩ: “Nghieđn cứu tác dúng cụa bài thuơc Thách kim thang trong đieău trị sỏi nieơu quạn” đã nghieđn cứu bài thuơc với các vị như Kim tieăn thạo, Trách tạ, Rađu mèo, Keđ noơi kim, Uât kim và Hốt thách tređn 70 beơnh nhađn, kêt quạ 70,59% beơnh nhađn khỏi beơnh [16], [27]. Tác dúng cụa bài thuơc này chụ yêu dựa vào tính lợi tieơu và tính làm mịn sỏi ở những beơnh nhađn bị sỏi thaơn.
Qua kinh nghieơm dađn gian và các tài lieơu thu thaơp được đã cho thây vieơc đieău trị sỏi thaơn baỉng thuơc cĩ nguoăn gơc tự nhieđn thường dựa vào các cơ chê như làm
mịn hoaịc tan sỏi, tơng sỏi ra ngồi cơ theơ nhờ tác đoơng lợi tieơu hoaịc làm giãn cơ trơn giúp vieđn sỏi thốt ra ngồi deê dàng [7],[13],[14],[22],[27],[53],[106].
Veă maịt dược lý thực nghieơm, vieơc xađy dựng mođ hình táo ra sỏi tređn thú đeơ thử nghieơm trực tiêp là moơt vieơc khĩ khaín, do đĩ chúng tođi dựa vào mođ hình đieău trị sỏi thaơn theo các cơ chê tređn đeơ thử nghieơm cho các dược lieơu nghieđn cứu.
2.5.2.1 Thử nghieơm tác đoơng lợi tieơu
Tác đoơng lợi tieơu được thử nghieơm baỉng phương pháp Valette cại tiên[33].
Súc vaơt thử nghieơm:
- Sử dúng chuoơt cơng traĩng Mus wista, trĩng lượng P = 180 ± 20 g.
- Nuođi trong các chuoăng chuaơn (standard cages).
- Chuoơt được cho aín chê đoơ aín thí nghieơm và uơng nước tự do.
- 24 giờ trước thử nghieơm chuoơt được chuyeơn sang các loăng biên dưỡng
(metabolic cages) chư được cho uơng nước, khođng cho thức aín.
Dúng cú: loăng biên dưỡng đeơ giữ chuoơt và hứng nước tieơu trong thời gian thử nghieơm, bơm và kim tieđm, kim cho uơng thuơc.
Mău thử nghieơm: Các boơt dược lieơu Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om laăn lượt được đem chiêt
xuât baỉng coăn 96% và coăn 60%. Bã dược lieơu
cịn lái được chiêt tiêp baỉng coăn 20% (phađn đốn 7*) .
Gom 2 dịch coăn cao đoơ cụa moêi dược lieơu, lối táp, cođ thu hoăi dung mođi cĩ được cao coăn. Cao coăn cụa moêi lối dược lieơu được đem chiêt laăn lượt (phađn bơ lỏng-lỏng) với các dung mođi sau: ether daău hỏa (1), benzen (2), diclorometan (3), ether ethylic (4), ethyl acetat (5), n-butanol (6). Cođ thu hoăi dung mođi được các phađn đốn tương ứng.
Moơt sơ mău được chĩn đeơ thử tác đoơng lợi tieơu goăm:
- CH (C1, Co, C7) KTT (K1, K2, K7) RO (R1, R2, R7)
- Chât tinh khiêt: M1 (Chuơi hoơt), Ds1, Ds2 (Kim tieăn thạo), L1, L2, L3 (Rau
om)
Ghi chú:
C1, K1, R1: phađn đốn ether daău hỏa cụa Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om
K2, R2 : phađn đốn benzen cụa Kim tieăn thạo và Rau om
C7, K7, R7 : phađn đốn coăn 20% cụa 3 dược lieơu tređn
Co : caĩn cịn lái sau khi chiêt cao coăn Chuơi hoơt baỉng ether daău hỏa Các mău này cĩ được từ dịch chiêt các phađn đốn dung mođi cĩ đoơ phađn cực khác nhau neđn khĩ tan trong nước, chât dimethyl sulfoxid (DMSO) được chĩn làm chât trợ tan, giúp hịa tan mău.
Tiên hành thử nghieơm:
Chuoơt được phađn vào các lođ tương ứng: Lođ thử: 9 con/mău, chia làm 3 laăn thử, moêi laăn 3 con. Mău thử nghieơm: cao thử nghieơm + DMSO + nước cât.
Lođ chứng: DMSO + nước cât.
Theơ tích dung dịch đưa vào dá dày chuoơt cụa lođ thử và lođ chứng là 3ml / con. Lieău thử nghieơm được dị tìm tređn cơ sở lieău thođng thường dùng cho người và theo nguyeđn taĩc taíng daăn [5].
Moêi con chuoơt trong cạ hai lođ thử và lođ chứng đeău được tieđm dưới da 1ml/100g theơ trĩng dung dịch NaCl 0,9% khi thí nghieơm.
Chư tieđu theo dõi: đo theơ tích nước tieơu trong 6 giờ lieđn túc và sau 24 giờ sau
khi cho chuoơt uơng nước hoaịc thuơc.
Tính kêt quạ: theo phương pháp Valette cại tiên Kêt quạ được theơ hieơn baỉng % lợi tieơu và chư sơ T: % Lợi tieơu =
V V '
V
× 100 V’ : theơ tích trung bình cụa nước tieơu lođ thử
V : theơ tích trung bình cụa nước tieơu lođ chứng Chư sơ T =
V '
V Nêu T > 1 : thuơc cĩ hướng lợi tieơu
Nêu T < 1 : thuơc khođng cĩ hướng lợi tieơu Kêt quạ cịn được tính theo thơng keđ, dùng test student đeơ xem xét sự khác bieơt giữa lođ thử và lođ chứng.
2.5.2.2 Thử nghieơm tác đoơng giãn cơ
Thử nghieơm tác đoơng giãn cơ được tiên hành tređn đốn ruoơt non cođ laơp, kêt quạ được bieơu thị baỉng cách so sánh bieđn đoơ và taăn sơ co bĩp cụa ruoơt khi tiêp xúc với dung dịch thử nghieơm và/với dung dịch chứng.
- Dung dịch Tyrode (dung dịch chứng)
dịch cĩ hàm lượng 1 mg/60 ml.
- Hyoscin butylbromide (Buscopan) ơng 20mg/ml (Boehringer-Ingelheim): pha thành dung dịch cĩ hàm lượng 1 mg/60 ml.
Dung dịch Tyrode được dùng như dung dịch kieơm chứng, Histamin dihydrochloride hoaịc Hyoscin butylbromide dùng như chât kieơm tra và đơi chiêu.
- Mău thử: tương tự như nguyeđn lieơu dùng cho thử nghieơm lợi tieơu. Các mău
deê tan thì hịa trực tiêp và 5ml nước cât (C7, K7, R7). Các mău cịn lái khĩ tan thì
hịa vào dung mođi goăm cĩ nước cât và DMSO (dimethyl sulfoxid) với tư leơ 3:2
(ml/ml). Các chât tinh khiêt M1, Ds2, L1, L2, L3 được hịa vào cùng dung mođi như
tređn. Trước khi tiên hành thử nghieơm, tât cạ các dung dịch thử đeău được pha
lỗng trong 60 ml nước cât ở 37oC theo các noăng đoơ sau: 0,20 ml; 0,40 ml; 0,60 ml;
0,80 ml.
- Súc vaơt thử nghieơm: tương tự như thử nghieơm lợi tieơu (Chuoơt cơng Mus wista).
Hình 2.5 A. Chuoơt được moê búng đeơ lây phaăn ruoơt dùng cho thử nghieơm B. Đốn
ruoơt cođ laơp được nhúng vào dung dịch nuođi (Tyrode)
Chuoơt được làm chêt thaơt nhanh baỉng cách kép khí quạn, moơ và caĩt lây đốn ruoơt non dài chừng 2,5 cm, rửa sách baỉng dịch nuođi (dung dịch Tyrode). Cho khúc ruoơt đã chuaơn bị vào trong ơng nghieơm thụy tinh (3 x 11) cm, cĩ chứa sẵn
60 ml dung dịch Tyrode được làm âm ở 37oC và luođn cĩ luoăng khí oxy thoơi vào.
Moơt đaău khúc ruoơt được cơ định bởi moơt mĩc thuỷ tinh ở đáy ơng nghieơm, đaău
cịn lái nơi với bút ghi và heơ thơng trúc quay đeơ ghi lái bieđn đoơ (mm.phút-1), taăn
sơ (sơ laăn co bĩp cụa ruoơt trong 1 phút) cụa ruoơt tređn bieơu đoă gaĩn với máy quay
Kymograph (tơc đoơ quay 1,5 vịng/ phút). Cuơi cùng so sánh kêt quạ sau nhieău
laăn thử nghieơm tređn các lieău khác nhau cụa moêi mău thử.
Bieđn đoơ co bĩp và taăn sơ co thaĩt cụa ruoơt được ghi nhaơn sau khi theđm dung dịch Histamin hay Buscopan (chât đơi chiêu) và dung dịch thử nghieơm với các noăng đoơ khác nhau. Moêi thử nghieơm sẽ được tiên hành 3 laăn ở cùng đieău kieơn.
Chú thích: Bieđn đoơ được tính baỉng mm (là giá trị trung bình đo trong 1 phút), taăn sơ được tính theo chieău dài tređn baíng giây khaĩc ly, cứ đụ 20 ođ vuođng thì tương ứng với sơ laăn co bĩp cụa ruoơt trong 1 phút.
2.5.2.3 Thử nghieơm tính mịn sỏi [14]
- Mău sỏi: sỏi do khoa tiêt nieơu beơnh vieơn Bình Dađn (TPHCM) cung câp, được tiên sĩ Traăn Thanh Nhãn (Boơ mođn Sinh hố-Đái hĩc Y Dược TP Hoă Chí Minh)
phađn lối là sỏi calci oxalat với các vieđn sỏi 2A, 2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 6A, 6B, 6C (các
đưnh đaịc trưng phoơ IR là 1618.2, 1315.4,781.1). Xemphú lúc (PL-1).
- Dung dịch thử: cao nước cụa dược lieơu (Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om) được chuaơn bị baỉng cách cađn 200 gam moêi dược lieơu, caĩt ngaĩn cho vào noăi, theđm nước vào nâu sođi trong 3 giờ, lĩc. Bã cịn lái cho nước vào nâu tiêp, lĩc. Gom dịch lĩc lái và cođ tređn bêp đên dáng cao đaịc. Đaịc đieơm cụa các cao được trình bày trong Bạng 2.7.
Bạng 2.7 Đoơ aơm và hàm lượng (khođ tuyeơt đơi) cụa các cao nước từ các dược lieơu trong thử nghieơm tính mịn sỏi
Dược lieơu Chuơi hoơt Kim tieăn thạo Rau om
Đoơ aơm (%) 38 25 45
Hàm lượng cao/DL (%) 8,5 12 13,5
- Tiên hành: chuaơn bị sỏi, rửa sách, sây ở 50C đên khơi lượng khođng đoơi.
Cađn
noăng đoơ 1:1 và 1:10 cho moêi dược lieơu), cho sỏi vào. Đaịt cơc vào máy đieău nhieơt ở 37C. - Cháy máy (đieău nhieơt) vào lúc 8 giờ sáng và laĩc cơc theo quy định:
• Buoơi sáng: laĩc 4 laăn theo moơt thao tác (laĩc nhé qua lái) trong 1 phút. Giờ laĩc: 8: 30 ; 9:30 ; 10:30ø và 11:30 giờ.
• Buoơi chieău: laĩc 3 laăn như tređn
Giờ laĩc: 14:00 ; 15:00 ; và 16:00 giờ. Taĩt máy. - Ngày thứ 2 và thứ 3 tiên hành như ngày đaău.
- Ngày thứ 4: 8 giờ baơt máy và 9 giờ laĩc đeău như tređn trong 1 phút. Taĩt máy. - Rửùa sách các vieđn sỏi tređn baỉng nước sách, tráng lái baỉng nước cât. Sây vieđn
sỏi ở 50C đên khơi lượng khođng đoơi. Cađn lái khơi lượng vieđn sỏi.
Khơi lượng sỏi tan vào các dung dịch thử nghieơm là hieơu sơ giữa khơi lượng cađn cụa vieđn sỏi trước và sau khi thử nghieơm.
Moêi vieđn sỏi thử nghieơm ở các noăng đoơ cao khác nhau sẽ được thử lieđn tiêp 3 đợt theo qui trình tređn.
2.5.2.4 Thử nghieơm tác đoơng kháng khuaơn
- Nguyeđn taĩc: dùng phương pháp pha lỗng tređn mođi trường raĩn đeơ xác định noăng đoơ ức chê tơi thieơu (MIC) cụa các chât thử nghieơm [78].
* Mođi trường hốt hĩa vi khuaơn thử nghieơm: Tryptic Soy Broth (TSB) * Mođi trường thử nghieơm : thách Mueller - Hinton agar (MHA) * Chuaơn đoơ đúc: sử dúng thang đoơ đúc Mc Farland 0,5
* Vi khuaơn thử nghieơm:Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus
aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 và MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) [78 ].
- Mău thử: các dược lieơu Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om được chiêt xuât thành cao coăn. Rieđng Rau om cịn dùng theđm tinh daău và nước ép tươi.
Bạng 2.8 Đaịc đieơm các cao dùng trong thử nghieơm tính kháng khuaơn
Đaịc đieơm cao dược lieơu Trĩng lượng cao (g) Tỷ leơ cao/DL (%) Đoơ aơm (%)
Chuơi hoơt 94,45 18,89 35
Kim tieăn thạo 28,68 5,7 28
2.5.2.5 Thử nghieơm đoơc tính câp dieên
Theo phương pháp Boơ Y tê Vieơt Nam ban hành (thođng tư 371) [5], [15]
- Nguyeđn lieơu: cao coăn tương tự như trong thử nghieơm tính kháng khuaơn. - Súc vaơt thử nghieơm: dùng chuoơt nhaĩt traĩng chụng Swiss albino, 5 tuaăn tuoơi,
P = 20 2 g/con do vieơn Pasteur TP Hoă Chí Minh cung câp, chuoơt được nuođi oơn
định ít nhât 1 tuaăn trước khi tiên hành thử nghieơm.
Tiên hành: chuoơt nhaĩt được chia thành nhieău nhĩm tương tự nhau, những con ở cùng nhĩm sẽ nhaơn cùng moơt lieău chât khạo sát. Sự đánh giá dựa vào phạn ứng tồn ứng hay bât ứng (sơng hay chêt) nhaơn thây ở moêi thú thử nghieơm trong nhĩm. Sau khi cho chuoơt uơng thuơc (lieău duy nhât trong ngày), quan sát các hành vi, theơ tráng chuoơt sau 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Ghi nhaơn giờ xuât hieơn các trieơu chứng bât thường, giờ chêt. Nêu cĩ chuoơt chêt thì tiên hành xét nghieơm đái theơ chụ
yêu gan, thaơn, tim, phoơi. Xác định LD50 (lieău làm chêt 50% súc vaơt thử).
2.5.3 Nghieđn cứu veă hố hĩc
2.5.3.1 Xác định hàm lượng K+ trong Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om
Hàm lượng K+ cĩ trong các dược lieơu được xác định baỉng phương pháp
quang kê ngĩn lửa (Lisabio PHF 90 D).
Nguyeđn taĩc: dược lieơu được đơt và nung thành tro. Hồ tan tro với nước cât, lĩc qua giây lĩc. Dịch lĩc này là mău thử và được phađn tích baỉng máy quang kê ngĩn lửa, kêt quạ so sánh với dung dịch KCl chuaơn.
Tiên hành:
- Chuaơn bị dung dịch chuaơn: cađn chính xác 1,5 g KCl (đã sây khođ ở 130oC/1
giờ), hồ tan với nước cât 2 laăn vừa đụ bình định mức 1000 ml. Lây chính xác 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, theđm nước vừa đụ. Đađy là dung
dịch chuaơn (20 mEq KCl).
- Chuaơn bị dung dịch thử: cađn chính xác 1 gam dược lieơu (moêi lối dược lieơu thực hieơn 3 mău), đơt và nung thành tro đên khơi lượng khođng đoơi. Hồ tan kỹ tro tồn phaăn này với nước cât 2 laăn. Lĩc qua giây lĩc vào bình định mức 10 ml. Các
dung dịch này được đem đi phađn tích baỉng phương pháp quang kê ngĩn lửa.
2.5.3.2 Chât chiêt được tan trong coăn: tiên hành theo Dược đieơn Vieơt Nam III.
Cađn chính xác khoạng 2 gam dược lieơu đã được xay mịn, cho vào bình tam giác 250 ml nút mài. Theđm chính xác 50 ml dung mođi là coăn 95%, đaơy nút, cađn chính xác đên 0,01 g. Laĩc đeău và đeơ yeđn trong 1 giờ. Laĩp sinh hàn hoăi lưu đun sođi nhé trong 1 giờ. Đeơ nguoơi và cađn đieău chưnh khơi lượng bình như khơi lượng ban đaău baỉng dung mođi. Laĩc đeău và lĩc nhanh qua giây lĩc khođng taơm dung mođi. Lây chính xác 25 ml dịch lĩc vào moơt becher 50 ml, cođ tređn cách thụy cịn khoạng 5 ml, chuyeơn tồn boơ dịch này vào moơt chén kêt tinh đã được sây khođ đên khơi lượng khođng đoơi và cađn bì. Tiêp túc làm khođ dịch lĩc tređn cách thụy,
sau đĩ đem sây ở 100-105 °C trong 3 giờ. Đeơ nguoơi trong bình hút aơm, cađn.
Hàm lượng chât tan trong coăn được tính theo cođng thức: h a b X 100 20000 %
a: khơi lượng dược lieơu (g) b : khơi lượng caĩn cađn được (g) h : đoơ aơm cụa dược lieơu (%)
2.5.3.3 Chiêt xuât và định lượng tinh daău [23]
Dùng phương pháp cât kéo theo hơi nước, sử dúng dúng cú Clevenger [4][23].
Tinh daău cĩ được sẽ đem lối nước baỉng NaSO4 khan. Đeơ nơi mát tránh ánh sáng.
2.5.3.4 Sơ boơ khạo sát thành phaăn hĩa hĩc
Áp dúng phương pháp cụa boơ mođn Dược Lieơu-Khoa Dược-Đái hĩc Y Dược TP Hoă Chí Minh (cại tiên từ phương pháp cụa trường Đái hĩc Dược khoa Rumani) [3]. Nguyeđn taĩc là dựa vào đoơ hịa tan cụa các hợp chât trong dược lieơu đeơ tách chúng baỉng dung mođi cĩ đoơ phađn cực khác nhau. Sau đĩ xác định các hợp chât baỉng các phạn ứng chuyeđn bieơt.
2.5.3.5 Chiêt xuâtdược lieơu
Sử dúng phương pháp chiêt xuât ngược dịng laăn lượt với EtOH 96% và EtOH 60%. Hai dịch chiêt được goơp chung lái, lối táp, thu hoăi dung mođi được cao coăn. Cao coăn này được chiêt phađn đốn với các dung mođi cĩ đoơ phađn cực taíng daăn (1. Ether daău hỏa, 2. Benzen, 3. Diclorometan, 4. Ether ethylic, 5. Ethyl acetat, 6.
n-butanol). Thu hoăi dung mođi ta được các phađn đốn tương ứng. Các phađn đốn này được đem thử nghieơm dược lý tređn 2 mođ hình lợi tieơu và
giãn cơ. Kêt quạ khạo sát cĩ được, kêt hợp với tham khạo tài lieơu đeơ định hướng cho
các nghieđn cứu hố hĩc kê tiêp.
2.5.3.6 Phađn laơp
Các kỹ thuaơt sau đađy được dùng đeơ phađn laơp các chât:
- Saĩc ký hâp phú: SKLM và SK coơt (SK coơt nhanh, SK coơt coơ đieơn) - Saĩc ký rađy phađn tử
- Saĩc ký lỏng hieơu naíng cao bán đieău chê: sử dúng heơ thơng máy HPLC
hieơu Waters, coơơt LiChrospher 100 RP-18 (5 m) 4.0 mm (i.d.) x 250 mm. Các
đieău
kieơn tiên hành cú theơ sẽ được trình bày trong từng chuyeđn múc thực nghieơm. - Kêt tinh phađn đốn
2.5.3.7 Xác định câu trúc cụa các chât tinh khiêt
Bieơn luaơn câu trúc các chât tinh khiêt baỉng cách kêt hợp các haỉng sơ vaơt lý và kêt quạ cụa các phoơ UV, IR, MS, GC-MS, LC-MS, NMR (1 chieău, 2 chieău). Moơt sơ trường hợp cĩ so sánh sơ lieơu phoơ với các dữ lieơu đã cođng bơ.
CHƯƠNG 3
KÊT QUẠ NGHIEĐN CỨU
3.1 KHẠO SÁT THỰC VAƠT HĨC
3.1.1 Nguyeđn lieơu nghieđn cứu: Chuơi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om
3.1.1.1 Chuơi hoơt
Hát Chuơi hoơt (Semen Musae balbisianae), được xử lý từ quạ chín cụa cađy Chuơi
hoơt (Musa balbisiana Colla), hĩ Chuơi (Musaceae).
Hieơu suât: 1 kg chuơi chín cho 20 g hát khođ (2%).
Hình 3.6 A. Nại chuơi hoơt B. Quạ chuơi hoơt caĩt ngang C. Hát chuơi hoơt D. Aûnh chúp hát chuơi hoơt phĩng to