1. 2G iới thieơu các dược lieơu nghieđn cứu
4.3 Bàn luaơn veă khạo sát hoá hĩc
Tređn cơ sở kêt hợp các phương tieơn và những tiên boơ mới trong lãnh vực nghieđn cứu như phương pháp HPLC áp dúng trong phađn tích và đieău chê , SPE trong tinh chêâ, APCI-MS trong phađn tích, ... moơt sô các hợp chât laăn đaău tieđn được phát hieơn trong các dược lieơu nghieđn cứu, cú theơ như sau:
- Từ Chuôi hoơt đã phađn laơp được M2 là hợp chât propelargonidin. Câu trúc
cụa M2 được chứng minh baỉng kỹ thuaơt LC-MS, phađn tử khôi M+ = 546 tương
ứng với propelargonidin dimer câu táo bởi 2 đơn phađn pelargonidin C15H14O5.
Qua tài lieơu tham khạo, các tác giạ chư đeă caơp moơt cách toơng quát trong hát Chuôi hoơt có proanthocyanidin mà thođi. Như vaơy, đađy là laăn đaău tieđn propelargonidin được phađn laơp từ Chuôi hoơt, flavonoid này toăn tái trong thieđn nhieđn ở dáng trùng hợp dimer.
- Đôi với Kim tieăn thạo, theo các tác giạ Su, Y. L.; Wang, Y. L.; Yang, J. S.
(1993) từ phađn đốn nước cụa Kim tieăn thạo đã phađn laơp được 3 C-glycosid là
vicenin-1, vicenin-3 và schaftosid. Trong phaăn nghieđn cứu phađn đốn n-butanol
cụa Kim tieăn thạo mĩc ở Vieơt Nam, chúng tođi đã phađn laơp được 3 C-glycosid
nữa, đó là Ds3 (isoschaftosid), Ds5 và Ds6.
Qua các sô lieơu phoơ nghieơm đã xác định câu trúc cụa Ds3 , Ds5 và Ds6 là các
apigenin 6,8- di-C- glycosid:
• Apigenin 6-C--L arabinopyranosyl 8-C--D- glucopyranosid
(isoschaftosid) (Ds3).
• Apigenin 6-C--L-arabinopyranosyl-8-C--D-xylopyranosid (Ds6)
Đađy là những flavon C-glycosid laăn đaău tieđn phađn laơp trong Kim tieăn thạo.
Trong sô này, theo hieơu biêt cụa chúng tođi, Ds6 là moơt chât mới.
Theo các tài lieơu [60],[61],[85] từ phađn đốn nước cụa Kim tieăn thạo, các
tác giạ nước ngoài đã phađn laơp, khạo sát các flavonoid ở chi Desmodium cho
thây ở vòng A thường có nhieău nhóm thê như vitexin, isovitexin, gangetin, genistein, kaempferitrin, desmodin, vicenin-1, vicenin-3, schaftosid v.v… Kêt quạ
khạo sát cụa chúng tođi cho thây các chât (Ds3), (Ds5) vaø (Ds6) vừa phađn laơp được
cũng có những đaịc đieơm tương tự.
- Đôi với Rau om đã phađn laơp được:
• Acid betulinic (3-) (L1), là moơt triterpen được tìm thây trong vỏ cađy
Betula spp., Rhododendron arboreum (Ericaceae) [71]. Beđn cánh tính giãn cơ, acid betulinic còn có tác dúng kháng vieđm, kháng khôi u (antitumour), có khạ naíng chông lái heơ thông táo khôi u Walker carcinoma 256 [60].
• Nevadensin (L2), moơt aglycon flavonoid khá hiêm chư được phađn laơp trước
đađy từ Iva nevadensis và từ Lysionotus pauciflorus (Gesneriaceae), có tính
kháng vieđm[66]. Qua thử nghieơm cụa chúng tođi chât này còn có tính giãn cơ.
• Gardenin B (L4), moơt aglycon flavonoid đã được phađn laơp từ vỏ quạ
Citrus jambhiri (Rutaceae), nhựa daău cụa Gardenia lucida (Rubiaceae).
• Nevadensin 7-O--D-glucopyranosid (L5), moơt flavonoid glycosid được
phađn laơp từ Lysionotus pauciflorus (Gesneriaceae). Tác giạ trước đađy đã bieơn
luaơn câu trúc chât này baỉng cách thụy phađn đeơ xác định phaăn genin và phaăn đường. Trong tài lieơu này chúng tođi đã boơ sung theđm veă câu trúc cụa phaăn
đường nhờ các phương tieơn phoơ hieơn đái như HSQC, HMBC. DQF-COSY… mà
khođng caăn phại thuỷ phađn.
• Isothymusin (L6) chư mới được tìm thây trong Ocimum grandiflorum, L7 là
pilosin cũng chư mới được tìm thây trong Ocimum americanum var. pilosum
(Lamiaceae).
• 8-Hydroxy salvigenin (L8) , trước đađy Krisnan & coơng sự đã cođng bô câu
trúc cụa moơt flavonoid từ cađy L. gratissima là salvigenin [67], [68].
Qua tham khạo và so sánh với các tài lieơu, chúng tođi nhaơn định các
flavonoid L1 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 là những chât laăn đaău tieđn được xác định là
thành phaăn cụa Rau om (Limnophila aromatica (Lamk.) Merr.,
Scrophulariaceae).
Các flavonoid được phát hieơn trong Rau om như nevadensin, nevadensin-7-
O--D glucopyranosid và ba flavon bị hydroxy hoá ở vị trí C-8 (L6 : 8-hydroxy
cirsimaritin isothymusin 5,8,4’-trihydroxy-dimethoxy flavon), (L7 : 8-hydroxy
pectolinarigenin pilosin 5,7,8 -trihydroxy-6,4’-dimethoxy flavon), (L8 : 8-
hydroxy salvigenin 5,8-dihydroxy-6,7,4’-trimethoxy flavon) khá hiêm gaịp
trong giới thực vaơt, moơt sô tác giạ sử dúng chúng trong hoá phađn lối thực vaơt [58],[74],[79].
L5 : nevadensin-7-O--D glucopyranosid và L8 :8-hydroxy salvigenin chư
được cođng bô moơt laăn trước đađy. Ngoài chât L5 laăn đaău tieđn được phađn laơp
từ cađy Lycionotus pauciflorus thuoơc hĩ Gesneriaceae vào naím 1998, các chât
còn lái đeău đã tìm thây ở hĩ Hoa mođi (Lamiaceae) là moơt hĩ rât gaăn gũi với hĩ Hoa mõm sói (Scrophulariaceae) cụa Rau om [46], [71],[86].
• Tinh daău Rau om : đã xác định hàm lượng và thành phaăn câu táo cụa tinh daău Rau om. Qua khạo sát hóa hĩc cho thây hàm lượng tinh daău Rau om mĩc ở Vieơt Nam là 1,5% cao hơn Rau om Ân Đoơ 10 laăn (0,13%), có sự sai bieơt này có theơ là do cách tính toán (chúng tođi tính hàm lượng tinh daău tređn dược lieơu khođ tuyeơt đôi); cũng có theơ do ạnh hưởng cụa thoơ nhưỡng mà hàm lượng có khác nhau. Qua so sánh với tài lieơu tham khạo chúng tođi nhaơn thây thành phaăn câu táo
cụa tinh daău khá giông nhau. Cạ hai đeău có thành phaăn chính là d-limonen
(42%), (S-) -(4-isopropenyl-1-cyclohexanyl) methanol (18,7%) và d-
perillaldehyd (4,4%) [J.Venkata, K.Srinivasan, 1989].
Đã khạo sát được hàm lượng tinh daău Rau om mĩc ở các vùng khác nhau như thành phô Hoă Chí Minh (1,50%), thành phô Hà Noơi (1,56%), đoăng baỉng sođng Cửu Long (Đoăng Tháp) 1,58% và cao nguyeđn (Lađm Đoăng) 1,70%. Từ kêt quạ này cho thây mău dược lieơu Rau om troăng ở cao nguyeđn cho hàm lượng tinh daău cao nhât.
Hĩ Scrophulariaceae và hĩ Lamiaceae có nhieău đieơm tương đoăng veă hình thái thực vaơt, đeău thuoơc Boơ Lamiales và có lieđn heơ rât gaăn theo cơ sở trình tự ADN, cùng sạn sinh iridoid glycosid và caffeoyl phenylethyl glycosid (57). Tuy nhieđn, hĩ phú Nepetoideae, veă maịt hoá hĩc được biêt là hĩ chứa những dăn xuât baơc cao như tinh daău có nhieău trong hĩ Lamiaceae. Trong khi đó hĩ Scrophulariaceae thì thường táo ra những dăn chât monoterpenoid iridoid glycosid thay vì tinh daău [58]. Đứng veă maịt hóa phađn lối mà nói, sự hieơn dieơn cụa tinh daău và những flavonoid như tređn ở cađy Rau om moơt laăn nữa khẳng định môi lieđn heơ chaịt chẽ và gaăn gũi giữa hĩ Scrophulariaceae và Lamiaceae.
Định tính
saponin, tanin và phytosterol... chúng tođi chĩn tanin và flavonoid làm cơ sở đeơ định tính vì chúng có những đaịc tính khá đaịc trưng: tanin tụa với thuôc thử gelatin muôi; flavonoid ở dáng proanthocyanidin, nêu chư thực hieơn phạn ứng
cyanidin thođng thường kêt quạ sẽ ađm tính, do đó phạn ứng cụa flavonoid này
được thực hieơn trong mođi trường acid và đun nóng là khá đaịc hieơu cho hát Chuôi
hoơt.
- Đôi với Kim tieăn thạo: Kim tieăn thạo có thành phaăn chính là
flavonoid,
saponin, alcaloid và phytosterol... chúng tođi chĩn flavonoid và alcaloid làm cơ sở đeơ định tính.
Theo kêt quạ phađn tích ở phaăn hoá hĩc (3.3.2) chúng tođi nhaơn thây alcaloid ở trong Kim tieăn thạo đaịc bieơt nháy với acid silicotungstic (TT Bertrand) và với iod và iodid (TT Bouchardat); còn với kali iodobismuthat (TT Dragendorff) và trinitrophenol (TT Hager) phạn ứng kém nháy, đođi khi caăn moơt thời gian tụa mới xuât hieơn [80].
Beđn cánh định tính dược lieơu baỉng các phạn ứng hóa hĩc thì hình dáng beđn ngoài, câu táo vi hĩc cũng là những đaịc đieơm hữu ích đeơ xác định. Đôi với Kim tieăn thạo với dáng lá hình tròn có gađn phú song song đaịc bieơt là những đaịc đieơm khá đieơn hình. Hơn nữa veă maịt vi hĩc, lođng che chở đa bào rât dài với 1 hoaịc 2 tê bào rât ngaĩn ở gôc, lođng tiêt đa bào phình to ở gôc là những đaịc đieơm khá chuyeđn bieơt cụa dược lieơu này.
- Đôi với Rau om: trong Rau om có thành phaăn chính là tinh daău, flavonoid,
dược lieơu này có tác dúng tôt, chúng tođi chĩn flavonoid làm cơ sở đeơ định tính. Phạn ứng cyanidin cho kêt quạ dương tính rõ.
Phương pháp dùng SKLM cho vêt tương đương với vêt chuaơn (chât chuaơn ở đađy là chuaơn đôi chiêu nevadensin), có Rf khoạng 0,61 với heơ dung mođi đã chĩn.
Phương pháp saĩc ký lỏng hieơu naíng cao so sánh với nevadensin là phương pháp nháy và đaịc hieơu đeơ định tính Rau om.
Đaịc đieơm thực vaơt cũng giúp ích rât nhieău cho vieơc nhaơn định cađy Rau om với lá mĩc vòng 3, hoa cođ đoơc ở nách lá, cađy có mùi thơm đaịc trưng. Đaịc đieơm veă vi hĩc khá đieơn hình cho thực vaơt sông gaăn nước với nhieău khuyêt to vùng mođ meăm, rieđng ở phaăn thađn những khuyêt này rât to và nhieău, ngaín cách nhau chư bởi 1 dãy tê bào trođng rât đaịc saĩc.
Định lượng
Trước đađy, trong các tài lieơu haău như khođng thây đeă caơp đên tieđu chuaơn kieơm nghieơm cụa 3 dược lieơu này. Mãi đên Dược đieơn III thì mới có 1 chuyeđn luaơn
ngaĩn veă Kim tieăn thạo, chư đeă caơp đên 2 phạn ứng định tính dựa vào flavonoid (phạn ứng Cyanidin) và alcaloid (phạn ứng táo tụa với TT Dragendorff và TT Hager).
Trong cođng trình này chúng tođi đã xađy dựng phương pháp kieơm nghieơm cho 3 dược lieơu nghieđn cứu. Đôi với Chuôi hoơt, ngoài các tieđu chuaơn veă thực vaơt, định tính đã trình bày ở phaăn trước, chúng tođi đã xác định được hàm lượng chât tan trong coăn cho dược lieơu này. Đađy là moơt phương pháp thường được sử dúng trong Dược đieơn Anh (Phaăn phú lúc dành cho cađy thuôc), các bước tiên hành khá đơn
Đôi với Kim tieăn thạo và Rau om thì ngoài các tieđu chuaơn chung veă thực vaơt và định tính, chúng tođi đã xađy dựng tieđu chuaơn định lượng cho hai dược lieơu này baỉng phương pháp saĩc ký lỏng hieơu naíng cao. Với phương pháp này, ngoài vieơc định lượng 2 flavonoid (isoschaftosid cho Kim tieăn thạo và nevadensin cho Rau om) tieđu bieơu có hàm lượng cao trong cađy, chúng tođi cũng có theơ định lượng những flavonoid khác có trong thành phaăn cụa 2 dược lieơu tređn dựa vào dieơn tích
đưnh cụa các đưnh được tách rieđng tređn saĩc ký đoă. Trong trường hợp này các max
cụa các đưnh khođng quá cheđnh leơch, heơ sô taĩt phađn tử (molar extinction coefficient) quy veă flavonoid chuaơn. Hàm lượng flavonoid toàn phaăn có trong dược lieơu sẽ là tích hợp các hàm lượng tương ứng cụa các đưnh.
KÊT LUAƠN
Qua thời gian thực hieơn luaơn án:” Nghieđn cứu ba dược lieơu hướng tác dúng đieău trị
sỏi thaơn Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om”, đeă tài đã thu được các kêt quạ như sau:
1. Khạo sát thực vaơt hĩc
- Đã thu thaơp mău nghieđn cứu ở moơt sô nơi tređn lãnh thoơ Vieơt Nam. Caín cứ vào
đaịc đieơm thực vaơt, đôi chiêu với khóa phađn lối và sự trợ giúp cụa các nhà thực vaơt hĩc đã xác định teđn chính thức cụa các dược lieơu Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om.
- Đã khạo sát đaịc đieơm vi hĩc (vi phău và boơt) cụa các dược lieơu nghieđn cứu.
Những kêt quạ nghieđn cứu veă thực vaơt hĩc góp phaăn tieđu chuaơn hóa các dược lieơu.
2. Tác dúng sinh hĩc
- Đã khạo sát tính kháng khuaơn cụa các dược lieơu, kêt quạ cho thây tinh daău
Rau om có theơ hieơn tính kháng khuaơn tređn Streptococcus faecalis, Staphylococcus
aureus và cạ MRSA, tuy với MIC khá cao. Dịch chiêt coăn cụa các dược lieơu có
theơ hieơn tính kháng khuaơn tređn trực khuaơn mụ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
nhưng yếu. Trong khi đó dịch chiêt nước và cao nước Rau om khođng theơ hieơn
tính kháng khuaơn tređn vi khuaơn thử nghieơm.
- Thử nghieơm lợi tieơu và giãn cơ đã xác định được những phađn đốn có tác
dúng. Từ những phađn đốn này baỉng các kỹ thuaơt hóa hĩc đã phađn laơp được 12
chât tinh khiêt, trong đó có 6 chât được thử nghieơm có tác dúng sinh hĩc là:
• M1 (sitosterol, stigmasterol) từ Chuôi hoơt: có hướng tác đoơng lợi tieơu và có
tác đoơng giãn cơ.
• Ds1 (acid palmitic), Ds2(sitosterol, stigmasterol)từ Kim tieăn thạo: có tác đoơng lợi tieơu.
• L1(acid betulinic), L2 (nevadensin), L3(24-z-methylen homocholesterol) từ
Rau om có tác đoơng giãn cơ.
dược lieơu. Kêt quạ cho thây dịch chiêt nước Kim tieăn thạo và Chuôi hoơt bước
đaău có moơt sô tác đoơng làm mòn sỏi.
- Đã khạo sát đoơc tính câp dieên cụa các dược lieơu, kêt quạ cho thây chúng
khođng theơ hieơn đoơc tính tređn lieău thử nghieơm, xét nghieơm đái theơ các cơ quan phụ táng cụa chuoơt thử nghieơm rât bình thường.
Qua tác đoơng lợi tieơu, giãn cơ và mòn sỏi cụa các cao chiêt Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om đã phaăn nào chứng minh được ý nghĩa khoa hĩc cụa vieơc sử dúng các dược lieơu tređn trong vieơc làm thuôc đieău trị sỏi thaơn trong nhađn dađn. Maịt khác, những kêt quạ thử sinh hĩc đã giúp định hướng cho phaăn nghieđn cứu hóa hĩc.
3. Hóa hĩc
Từ các dược lieơu Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om chúng tođi đã phađn laơp
và xác định câu trúc cụa 12 chât tinh khiêt baỉng phoơ NMR (1H, 13C-NMR,
HSQC, HMBC, DQF-COSY…) và 1 tinh daău baỉng saĩc ký khí khôi phoơ (GC- MS), định danh được 4 chât baỉng kỹ thuaơt HPLC-MSø (ACPI):
- Chuôi hoơt: sitosterol, stigmasterol (M1), propelargonidin ( M2).
Propelargonidin là chât laăn đaău tieđn xác định có trong hát Chuôi hoơt.
- Kim tieăn thạo: acid palmitic (Ds1), sitosterol, stigmasterol (Ds2 ),
·Apigenin 6-C--L- arabinopyranosyl 8-C--D-glucopyranosid
(Isoschaftosid) (Ds3)
·Apigenin 6,8-di-C--L-arabinopyranosid (Ds5)
·Apigenin 6-C--L- arabinopyranosyl-8-C--D-xylopyranosid (Ds6)
Theo kieơm tra cụa chúng tođi Ds3 , Ds5 , Ds6 là những flavonoid chưa
được
cođng bô từ Kim tieăn thạo. Trong sô này Ds6 là chât chưa được cođng
trong các tài lieơu tham khạo.
- Rau om: Acid betulinic (3-) (L1),nevadensin (L2), 24-z-methylen- homo
cholesterol (L3), gardenin B (L4), nevadensin 7-O--D-glucopyranosid (L5),
isothymusin (L6), pilosin (L7),8-hydroxy salvigenin (L8), pectolinarigenin (L9).
Theo kieơm tra cụa chúng tođi L1, L3, L4, L5, là những chât chưa được phađn laơp và
định danh từ Rau om .
Các chât L6,L7,L8, L9 là những chât được định danh laăn đaău tieđn từ Rau om..
Tinh daău Rau om có hàm lượng trung bình là 1,58%, có sự hieơn dieơn cụa ít
nhât là 14 chât, có thành phaăn chính là d-limonen (42%), (S)-(4-isopropenyl-1-
cyclohexanyl) methanol (18,7%) và d-perillaldehyd (4,4%).
Baỉng các sô lieơu cụa phoơ 1H, 13C-NMR, HSQC, HMBC, DQF-COSY đã xác
định câu trúc cụa L5 là nevadensin 7-O--D-glucopyranosid, khođng caăn thuỷ phađn.
Định lượng flavonoid trong Kim tieăn thạo và Rau om baỉng phương pháp HPLC
Đã xađy dựng tieđu chuaơn kieơm nghieơm Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo, Rau om. Goăm có:
- Chuôi hoơt: định tính dựa vào sự hieơn dieơn cụa tanin, flavonoid
(proanthocyanidin). Xác định hàm lượng chât tan trong coăn cụa Chuôi hoơt (X
15%).
- Kim tieăn thạo: định tính dựa vào sự hieơn dieơn cụa flavonoid (phạn ứng hoá hĩc) và alcaloid (phạn ứng hoá hĩc). Định lượng isoschaftosid trong Kim
tieăn thạo baỉng SK lỏng hieơu naíng cao (HPLC) (Cx 0, 5 %).
- Rau om: định tính dựa vào sự hieơn dieơn cụa flavonoid (phạn ứng hoá hĩc, SK lớp mỏng và HPLC) dựa vào nevadensin. Định lượng (nevadensin) trong
Rau om baỉng phương pháp SK lỏng hieơu naíng cao (HPLC) (Cx 0, 6%).
Từ các kêt quạ thu được đã xađy dựng tieđu chuaơn kieơm nghieơm cho các dược lieơu nghieđn cứu. Đieău này có theơ sẽ giúp ích cho vieơc chĩn lựa, thu mua nguyeđn lieơu làm thuôc nói rieđng, cũng như trong cođng tác kieơm nghieơm dược lieơu và các chê phaơm từ những dược lieơu này nói chung.
Qua kêt quạ nghieđn cứu, chúng tođi đã đát được những múc tieđu chụ yêu cụa đeă tài đeă ra là khạo sát veă maịt thực vaơt, tác dúng sinh hĩc và thành phaăn hóa hĩc cụa các dược lieơu Chuôi hoơt, Kim tieăn thạo và Rau om. Các kêt quạ nghieđn cứu đã góp phaăn chứng minh tác dúng và hieơu quạ đieău trị beơnh sỏi thaơn cụa các dược lieơu, các tieđu chuaơn kieơm nghieơm có theơ giúp cho chât lượng thuôc thành phaơm tôt hơn và tieơn dúng hơn.
KIÊN NGHỊ
Nêu cođng trình được tiêp túc, chúng tođi xin đeă nghị thực hieơn moơt sô cođng vieơc sau đađy:
- Hoàn thieơn phương pháp định lượng cho dược lieơu Chuôi hoơt.
- Nghieđn cứu theđm tác đoơng làm mòn sỏi cụa từng dược lieơu tređn từng lối sỏi
nhât là tác dúng cụa các chât tinh khiêt được phađn laơp từ 3 dược lieơu này. Có được kêt quạ này sẽ giúp cho vieơc đieău trị sỏi chuyeđn bieơt và hieơu quạ