2.11.1. Phổ hấp thu quang phổ UV-VIS
2.11.1.1. Cơ sở lý thuyết
Phương pháp hấp thu quang phổ UV-VIS được thực hiện dựa trên việc đo sự hấp thu ánh sáng từ ngoại hoặc khả kiến khi truyền qua dung dịch. Khoảng bước sóng được sửu dụng trong phương pháp bắt đầu từ vùng ngoại gần hay còn còn gọi là UV (khoảng 200 – 400 nm) đến vùng kiến hay còn gọi là VIS (khoảng 400 – 800 nm) [8,9].
Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng xác định đi qua một dung dịch mẫu được đặt trong bộ chứa mẫu, các phân tử hấp thu sẽ hấp thu một phần năng lượng bức xạ từ chùm sáng, phần ánh sáng còn lại sẽ truyền qua dung dịch. Khi xác định được năng lượng bức xạ của chùm ánh sáng truyền qua từ đó ta có thể xác định được nồng độ của dung dịch. Độ hấp thu bức xạ của một dung dịch sẽ tuân theo định luật Lambert – Beer:
A = - lgT = - lg = lg = εbC với T = (15) Trong đó:
PT là năng lượng bức xạ sau khi đi qua mẫu.
Po là năng lượng bức xạ ban đầu từ nguồn vào mẫu. ε là hệ số hấp thu mol, Lmol-1cm-1.
b là chiều dày lớp mẫu đo, cm. C là nồng độ mẫu, mol/L.
và nồng độ mẫu [8,9].
Hệ số hấp thu phân mol (ε) đặc trưng cho bản chất chất chất nghiên cứu, phụ thuộc vào độ dài sóng của ánh sáng đi qua và nhiệt độ; dung môi hòa tan, không phụ thuộc vào thể tích dung dịch, bề dày lớp dung dịch và năng lượng bức xạ ban đầu từ nguồn vào mẫu (Po). Do đó, đại lượng hệ số hấp thu phân mol được coi là tiêu chuẩn khách quan quan trọng nhất để đánh giá độ nhạy của phép định lượng trắc quang, hệ số hấp thu phân mol càng lớn, độ nhạy càng cao. Để có độ hệ số hấp thu phân mol lớn, chọn bước sóng max là bước sóng ứng với cực đại trên phổ hấp thu để thực hiện pháp đo.
Trong thực nghiệm đo hệ số hấp thu phân mol đo được cũng phụ thuộc một phần vào đặc điểm của thiết bị đo. Vì những lý do này những giá trị a xác định sẵn thường không được dùng cho phân tích định lượng, mà thường dùng một hoặc các dung dịch chuẩn có nồng độ chất phân tích đã biết [14].
Điều kiện nghiệm đúng định luật Lambert – Beer tuân theo là phải là hằng số. Có rất nhiều nguyên nhân làm cho đại lượng này thay đổi, có thể chia thành 3 nhóm chính:
- Nồng độ lớn: Theo định luật Lambert – Beer, mật độ quang A và nồng độ C của dung dịch có mối quan hệ tuyến tính. Điều này chỉ đúng trong một khoảng nồng độ Cmin + Cmax . Nếu nồng độ chất hấp thu quá thấp sẽ nằm dưới giới hạn phát hiện của máy đo Nếu nồng độ chất hấp thu quá cao thì càng cao độ lệch càng lớn.
- Thiết bị: Ánh sáng càng đơn sắc thì mức độ tuân theo định luật Lambert - Beer càng cao. Nhưng hiện nay vẫn chưa có thiết bị tạo được ánh sáng hoàn toàn đơn sắc, một thiết bị tách sắc tốt nhất cũng vẫn cho ánh sáng có độ rộng dải nhỏ, Ánh sáng đa sắc luôn luôn cho độ lệch âm với định luật Beer, nhưng hiệu ứng này nhỏ hơn nếu thực hiện việc đo độ hấp thu ở bước sóng Amax (là bước sóng ứng với cực đại trên phổ hấp thu ). Bên cạnh đó bức xạ phân tán cũng ảnh hưởng sự nghiệm đúng của định luật.
- Do các yếu tố hóa lý khác của dung dịch: sự trong suốt và đồng nhất của dung dịch, đại lượng pH, sự pha loãng, lực ion... [14].
2.11.1.2. Sơ đồ khối máy quang phổ UV-VIS
Hình 34: Sơ đồ khối máy quang phổ thông thường
Nguồn sáng được cung cấp từ đèn đa sắc, qua hệ thống quang học cung cấp nguồn bức xạ tương thích với quá trình đo. Một số nguồn bức xạ từ các loại đèn được sửu dụng trong các máy quang phổ hiện nay:
- Đèn vonfram (còn gọi là đèn dây tóc) phát ra ánh sáng có bước sóng từ 350 – 2500 nm (sử dụng trong vùng khả kiến) và có tuổi thọ của đèn khoảng 1200 giờ, - Đèn hydrogen và deutorium là hai lại đèn thuộc đèn phóng điện phát ra ánh sáng có bước sóng khoảng 200 – 450 nm (sửu dụng trong vùng tử ngoại) và có tuổi thọ khoảng 500 giờ.
- Đèn xeton cung là một loại đèn phóng điện phát ra ánh sáng có bước sóng khoảng 190 – 1000 nm. Đèn có cường độ ánh sáng cao và màu sắc gần với ánh sáng mặt trời do đó đèn xeton ít được sử dụng trong thiết bị UV-VIS thương mại.
Bộ tán sắc có nhiệm vị nhận chùm tia đa sắc từ nguồn sáng, phân tích và cho ra các tia đơn sắc, đặc trưng, chọn lọc. Một bộ tán sắc cơ bản gồm: Khe vào, hệ thống gương (thấu kính, gương, hệ thống khe), bộ tán sắc (kính lọc, lăng kính, cách tử) và khe ra.
Bộ chứa mẫu: Gồm hộc chứa, cuvette, dung dịch mẫu đo cho vào cuvette và được đặt trong hộc chứa. Cuvette có dạng hình chữ nhật hoặc trụ tròn có chiều dài quang là 1 cm, 2 cm, 5 cm và 10 cm… Cuvette có thể làm từ nhựa (nhựa PS, polystyrene) (đo vùng khả kiến, không sử dụng trường hợp dung môi hữu cơ cso
độ phân cực kém), thủy tinh (đo vùng khả kiến, có thể sử dụng trong trương hợp dung môi hữu cơ), silica nóng chảy hoặc thạch anh (đo vùng tử ngoại).
Detecter (đầu dò) có vai trò tiếp nhận, xử lý tiến hiệu quang thành tín hiệu điện và khuếch đại tín hiệu tới bộ ghi đo. Có hai loại đầu dò thường sửu dụng trong thiết bị UV-VIS:
- Loại thứ nhất ống phát xạ (photoemissive tube/ photo tube) và ống nhân quang (photomultiplier tube) có bề mặt nhạy sáng, hấp thu bức xạ trong vùng tử ngoại, khả kiến và hồng ngoại gần, tạo ra dòng điện tỉ lệ với số lượng photon đến đầu dò.
- Loại thứ thứ hai là tế bào quang điện (photovoltaic cell/ barrier layer cell) sử dụng chất bán dẫn làm bằng silicon hoặc selenium,…để thay thế cho bề mặt nhạy cảm. Giá trị dòng điện đo được sẽ tỉ lệ với cường độ và bước sóng của ánh sáng tới. Hoạt động ở bước sóng từ 250 – 1100 nm [8,9].
2.11.1.3. Một số máy quang phổ thông dụng a) Máy quang phổ một chùm tia
Trong máy quang phổ một chùm tia, chùm ánh sáng được truyền qua một bộ phận chứa mẫu duy nhất. Mẫu được đặt trong hộc chứa ánh sáng. Máy ra đời đầu tiên có cấu trúc đơn giản, dễ sử dụng nên giá thành thấp hơn các loại máy quang phổ khác.
Hình 35: Máy quang phổ một chùm tia
(Nguồn: https://www.tequipment.net/Jenway/630501/Spectrophotometer/)
Khi thực hiện đo trên máy, cần đo mẫu trắng trước sau đó thay thế mẫu trắng trong cuvette bằng mẫu thực. Sử dụng một cuvette hoặc cuvette chung cặp, chung lô sản xuất trong suốt quá trình đo [8,9].
b) Máy quang phổ hai chùm tia
Trong máy quang phổ hai chùm tia, ánh sáng đơn sắc sau khi ra khỏi bộ tách sắc sẽ được tách thành hai chùm, một chùm đi qua mẫu còn một chùm đi qua mẫu trắng. Mối chùm tia sẽ đưa tới detector để thu nhận tín hiệu. Mẫu và mẫu trắng được đo cùng một lúc nên tiết kiệm được thời gian và cho độ chính xác cao hơn máy một chùm tia. Mọi dao động của ánh sáng phát ra từ đèn đều áp dụng như nhau trên chùm tia mẫu và mẫu trắng. Máy có thể có hai detector hoặc chỉ một detector nhưng khi sử dụng một detector với sự hỗ trợ của bộ phận chẻ quang (chopper) sẽ cho kết quả chính xác hơn.
Hình 36: Máy quang phổ 2 chùm tia
(Nguồn: https://maydokhoahoc.com/pro.asp?pro=3087&may-quang-pho-2- chum-tia-c-7200s.htm)
Khi thực hiện đo trên máy, đặt dung dịch mẫu trắng vào cả hai vị trí, vị trí mẫu và vị trí tham chiếu (mẫu trắng), gán cho độ hấp thu A = 0. Tiếp thực hiện phép đo bằng cách thay dung dịch mẫu trắng ở vị trí mẫu bằng dung dịch cần đo [8,9].
c) Máy quang phổ mảng diode
Máy có hàng nghìn diode nhỏ sắp xếp thành một mảng. Mỗi diode sẽ phát hiện dải bước sóng ánh sáng hướng vào nó. Với thiết bị này, ánh sáng đa sắc được tham chiếu qua mẫu trước khi đi vào bộ quang học đa sắc (polychromator). Polychromator sẽ phân tán ánh sáng vào diode trong mảng, do đó mỗi diode sẽ đo một dải bước sóng rời rạc.
Ưu điểm của thiết bị này sẽ cho kết quả két song gần như ngay lập tức, tuy nhiên độ nhạy không cao và mẫu không nhất thiết phải đặt trong buồng tối [8,9].
Hình 37: Máy quang phổ mảng diode
(Nguồn: http://ajvietnam.com/dong-san-pham-uv-vis-diode-array/)
2.11.1.4. Nguyên tắc đo phổ UV-VIS
Chuẩn bị dung dịch chuẩn sao cho nồng độ của dung dịch chuẩn gần với nồng độ chất phân tích trong mẫu hoặc nằm giữa điểm chuẩn (kỹ thuật đường chuẩn). Độ chênh lệc giữa Cmax và Cmin trong dãy càng nhỏ càng tốt.
Hiệu chỉnh đường nền bằng dung dịch mẫu trắng. Sau đó quét phổ hấp thu của chất phân tích trong dung dịch chuẩn. Chon bước sóng tối ưu, thường là bước sóng cực đại có độ hấp thu cao nhất trong phổ, nếu có ảnh hưởng thì chọn bước sóng khác nhưng phải nằm trong bán chiều rộng quang phổ.
Khi sử dụng kỹ thuật đường chuẩn, dựng đường chuẩn với độ hấp thu được vẽ theo các nồng độ khác nhau. Từ đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu sau khi đo được ta tìm được nồng độ chất phân tích trong mẫu [8,9].
2.11.1.5. Cách sử dụng máy đo quang phổ UV-VIS
B1: Mở máy Sau đó mở phần mềm Spectra Measurement trên máy tính Instrument Fixed Wavelength Measure.
B2: Thiết lập bước sóng và số lần đo vào Measure Parameters Wavelength (nm)
B3: Chuẩn bị mẫu B4: Tiến hành đo
Đậy kín hai khoang đo và đóng kín vùng đo Nhấn Autozero để mặc định độ hấp thu trong không khí bằng 0.
Trước khi cho mẫu trắng vào cả hai cuvette nên tráng cuvette bằng một lượng dung dịch đó trước (cho lượng mẫu vào cuvette tối thiểu là ½ cuvette vfa không để tràn mẫu) Lau cuvette bằng khăn giấy mềm không bụi Đặt cuvette vào sao cho mặt nhẵn của cuvette hướng vào chùm tia sáng chiếu qua mẫu Thực hiện tương tự với cuvette mẫu trắng còn lại Đóng nắp Nhấn Baseline (để loại trừ các sai số do các chất không phải là chất cần xác định gây ra).
Sau khi bank xong thay một ống cuvette mẫu trắng thành mẫu thử Tiếp tục thực hiện các thao tác giống như đối với mẫu trắng Nhấn Sample đợi khi nút Start không còn nhấp nháy nữa là máy đã đo xong.
B5: Ghi nhận kết quả và xử lý số liệu.
2.11.2. Phạm vi áp dụng
Áp dụng phương pháp quang phổ 1,10-Phenanthrolin để xác định hàm lượng hàm lượng sắt trong acid axetic. Giới hạn dưới của phép xác định sắt là 0,0001% khối lượng [2][11].
Phương pháp áp dụng cho mẫu thử có chứa sắt từ 10 – 500 trong cùng một thể tích 60 mL.
2.11.3. Nguyên tắc
Dùng axit ascorbic khử toàn bộ sắt (III) trong dung dịch thử thành sắt (II). Tạo phức đỏ-cam giữa sắt (II) và 1,10-phenanthrolin tại pH từ 2 đến 9, và đo mật độ quang ở bước sóng 510 nm.
2.11.4. Thiết bị
- Thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thử nghiệm
- Thiết bị quang phổ, cuvet hấp thụ có chiều dài quang 1 cm, 2 cm và 4 cm hoặc 5 cm.
2.11.5. Thuốc thử
Trong tất cả các phép thử chỉ sử dụng thuốc thử có cấp tinh khiết phân tích với hàm lượng sắt thấp nhất và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương [11].
- Axit clohydric (HCl), dung dịch 180 g/L:
Pha loãng 409 mL dung dịch axit clohydric 38% (theo khối lượng), khối lượng riêng xấp xỉ 1,19 g/mL, với nước và định mức đến vạch 1000 mL, lắc đều, thực hiện tất cả các biện pháp bảo vệ cần thiết .
- Amoniac (NH3), dung dịch 85 g/L:
Pha loãng 374 mL dung dịch amoniac 25% (theo khối lượng), có khối lượng riêng xấp xỉ 0,910 g/mL, với nước và định mức đến vạch 1000 mL, lắc đều.
- Dung dịch đệm natri axetat/axit axetic (CH3COONa/CH3COOH), tại nhiệt độ 20oC với pH = 4,5:
Hòa tan 164 g natri axetat khan vào 500 mL nước, thêm 240 mL axit axetic băng, pha loãng và định mức đến vạch 1000 mL với nước.
- Acid ascorbic (C6H8O6), dung dịch 100 g/L (sử dụng trong 1 tuần).
- 1,10-Phenanthrolin hydroclorua monohydrat (C12H8N2.HCI.H2O) hoặc 1,10-Phenanthrolin monohydrat (C12H8N2.H2O), dung dịch 1 g/L:
Cân 1 g 1,10-Phenanthrolin hydroclorua monohydrat hoặc 1,10- Phenanthrolin monohydrat hòa tan, pha loãng và định mức đến vạch 1000 mL, lắc đều. Bảo quản dung dịch ở nơi tối tránh ánh sáng. Chỉ sử dụng các dung dịch không màu.
- Dung dịch chuẩn sắt A, dung dịch tiêu chuẩn tương ứng với 0,2 g Fe trong 1 L dung dịch.
Cân 1,727 g amoni sắt (III) sulfat dodecahydrat [NH4Fe(SO4)2.12H2O], chính xác đến 0,001 g, hòa tan bằng nước và chuyển vào bình định mức 1000 mL, thêm 20 mL dung dịch axit sulfuric đậm đặc (1:1) sau đó pha loãng và định mức đến vạch, lắc đều (1 mL dung dịch tiêu chuẩn này chứa tương ứng 0,2 mg Fe).
- Dung dịch chuẩn sắt B, dung dịch tiêu chuẩn tương ứng với 0,020 g Fe trong 1L:
Hút 50,0 mL dung dịch tiêu chuẩn sắt A đã chuẩn bị trên vào bình định mức 500 mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng nước, lắc đều (1 mL dung dịch tiêu chuẩn này chứa tương ứng 20 µg Fe) và chuẩn bị dung dịch này khi sử dụng.
Hình 38: Quy trình pha dung dịch tiêu chuẩn Fe
2.11.6. Cách tiến hành
2.11.6.1. Dung dịch mẫu trắng
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng cùng lúc với dung dịch mẫu thử. Không lấy dung dịch mẫu thử và sử dụng chính xác cùng lượng các thuốc thử được dùng để xác định, pha loãng và định mức đến cùng một thể tích.
2.11.6.2. Dựng đường chuẩn
Dùng pipet lấy chính xác dãy các dung dịch chuẩn sắt B vào bình định mức 100 mL:
Cuvet có chiều
dài quang, cm. Dung dịch tiêu chuẩn sắt (7.2.7), mL.
1 0 2,5 5 10 15 20 25
2 0 3 5 7 9 11 13
4 hoặc 5 0 0,5 1 2 3 4 5
Xử lý lượng mỗi bình như sau: Pha loãng dung dịch đến khoảng 60 mL (nếu cần) với nước và đưa pH đến khoảng 2 bằng dung dịch acid clohydric, kiểm tra pH bằng cách sử dụng giấy chỉ thị màu vàng. Thêm vào từng bình định mức thuốc thử sau theo trật tự và lắc đều sau mỗi lần thêm: 1 mL dung dịch acid ascorbic, 20 mL dung dịch đệm, 10 mL dung dịch 1,10-Phenanthrolin, sau đó pha loãng và định mức đến vạch bằng nước, lắc đều. Để yên khoảng 15 phút.
Đo độ hấp thụ các dung dịch sử dụng thiết bị quang phổ tại bước sóng tại 510 nm và sử dụng cuvet có chiều dài quang phù hợp (Bảng 1), điều chỉnh quang kế về độ hấp thụ zero bằng dung dịch mẫu trắng.
Dựng đường chuẩn độ hấp thu của dung dịch hiệu chuẩn theo microgram sắt có trong 100 mL dung dịch.
2.11.6.3. Phép xác định
Lấy 5 ml dung dịch thử đã được chuẩn bị (2.5) và chứa không quá 500 sắt trong 60 mL. Pha loãng đến thể tích 60 mL (nếu cần) và dùng dung dịch amoniac hoặc acid clohydric để điều chỉnh pH về khoảng 2 (thử bằng giấy pH). Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100 mL và thêm vào từng bình định mức thuốc thử sau theo trật tự và sau mỗi lần thêm vào lắc đều: 1 mL dung dịch acid ascorbic, 20 mL dung dịch đệm, 10 mL dung dịch 1,10-Phenanthrolin, sau đó pha loãng và định mức đến vạch bằng nước, lắc đều. Để yên khoảng 15 phút.
Đo độ hấp thụ các dung dịch sử dụng thiết bị quang phổ tại bước sóng tại 510 nm và sử dụng cuvet có chiều dài quang phù hợp (2.11.6.2), điều chỉnh quang kế
về độ hấp thụ zero bằng dung dịch mẫu trắng.
Hình 39: Sơ đồ quy trình
2.11.7. Tính toán
Từ đường chuẩn ta xác định được hàm lượng sắt có trong mẫu thử. Hàm lượng sắt, tính bằng % khối lượng được tính như sau:
% hàm lượng, sắt = (16) Trong đó:
M là khối lượng sắt tính theo theo đường chuẩn, . W là khối lượng mẫu đã sử dụng, g.