phương pháp nghiên cứu
3.7.2 Bố trí thí nghiệm
3.7.2.1 Thí nghiệm 1. Thành phần loài, tỷ lệ và cường độ nhiễm Fasciola spp ký sinh ở trâu, bò, dê huyện Gia Viễn, Nho Quan tỉnh Ninh Bình qua mổ khám.
* Thành phần loài Fasciola spp ở vùng nghiên cứu.
Quan tỉnh Ninh Bình.
- Làm tiêu bản nhuộm Carmin. - Mô tả hình thái cấu tạo của sán.
- Đối chiếu với hình thái cấu tạo của sán được xác định qua khoá phân loại của Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê, 1977 [42].
Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định loài sán lá gan Fasciola spp ở trâu, bò, dê tại vùng nghiên cứu.
* Tỷ lệ và cường độ nhiễm Fasciola spp tại các địa điểm nghiên cứu. - Mỗi huyện chọn 2 xã để nghiên cứu
- Mỗi huyện mổ trên 25 gia súc cho mỗi loài trâu, bò, dê. - Mổ khám túi mật, ống dẫn mật để thu thập sán trưởng thành. Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ nhiễm sán ở từng loài gia súc. - Cường độ nhiễm sán ở từng loài gia súc.
3.7.2.2 Thí nghiệm 2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Fasciola spp qua kiểm tra phân.
- Mỗi huyện chọn 2 xã để nghiên cứu.
- Mỗi xã lấy trên 30 mẫu phân của mỗi loài trâu, bò, dê ở các lứa tuổi khác nhau.
- Xét nghiệm phân tìm trứng sán Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ nhiễm sán ở gia súc tại các điểm nghiên cứu. - Cường độ nhiễm sán ở gia súc tại các điểm nghiên cứu. - So sánh tỷ lệ nhiễm tại hai vùng sinh thái.
- Biến động nhiễm sán ở trâu, bò, dê theo tuổi.
3.7.2.3 Thí nghiệm 3. Tình hình sử dụng rau thủy sinh làm thức ăn sống tại các nhà hàng và các hộ gia đình tại các điểm nghiên cứu.
- Nghiên cứu, điều tra, tại mỗi huyện chọn 40 hộ gia đình và 8 nhà hàng.
- Tìm hiểu tình hình và mức độ sử dụng rau thuỷ sinh làm thức ăn sống. Chỉ tiêu theo dõi:
- Loại rau người dân trong vùng nghiên cứu thường ăn sống. - Mức độ ăn sống thường xuyên hay không thường xuyên.
* Tỷ lệ nhiễm Adolescaria của Fasciola spp trên rau thuỷ sinh tại các điểm nghiên cứu.
- Thu thập các loại rau mà người thường dùng ăn sống có trong vùng nghiên cứu.
- Tìm Adolescaria của Fasciola spp. Chỉ tiêu theo dõi:
- Số lượng Adolescaria trung bình trên 1kg rau.
- Loại rau thuỷ sinh nhiễm Adolescaria của Fasciola spp
3.7.2.4 Thí nghiệm 4. Tình hình người nhiễm Fasciola sp tại tỉnh Ninh Bình.
- Điều tra thu thập thông tin về tình hình người nhiễm Fasciola spp tại các điểm nghiên cứu qua phòng dịch tễ các bệnh viện đa khoa huyện Gia Viễn, huyện Nho Quan. Phòng dịch tễ bệnh viện đa khoa tỉnh Ninh Bình.
- Điều tra tình hình người nhiễm Fasciola spp trong thời gian từ năm 2005 đến quý I năm 2009.
Chỉ tiêu theo dõi: - Số lượng người nhiễm sán lá gan qua các năm.
3.7.2.5 Thí nghiệm 5. Sự phát triển của trứng và ấu trùng Fasciola spp ở ngoại cảnh.
* Sự phát triển của trứng Fasciola spp trong điều kiện phòng thí nghiệm - Thu thập trứng sán lá loài Fasciola spp bằng phương pháp dội rửa túi mật và mổ tử cung sán trưởng thành, làm sạch và nuôi trong các đĩa petri có đường kính 10cm, chiều cao 1,5cm.
- Mật độ trứng sán trong đĩa khoảng 300 trứng/1 đĩa lồng.
- Nuôi trứng sán trong môi trường nước máy có pH = 7,2; môi trường kiềm và môi trường axít.
- Đo nhiệt độ phòng thí nghiệm ngày 2 lần: sáng (9 giờ), chiều (3 giờ). Chỉ tiêu theo dõi trong các môi trường:
- Sự phát triển của tế bào phôi trứng.
- Thời gian trứng phát triển tới Miarcidium.
Các quan sát được ghi chép đầy đủ, đo kích thước, mô tả và chụp ảnh. * Hình thái cấu tạo, kích thước và sức sống của Miracidium.
- Nuôi trứng tới khi Miracidium hình thành và thoát ra khỏi trứng. - Cố định hình thái Miracidium bằng cách hơ trên đĩa lồng có chứa ấu trùng hoạt động trên ngọn lửa đèn cồn.
- Quan sát mô tả, chụp ảnh và đo kích thước Miracidim. Chỉ tiêu theo dõi:
- Hình thái cấu tạo Miracidium. - Kích thước Miracidium.
- Thời gian sống của Miracidium trong nước
* Sự hoạt động và hình thành Adolescaria của Fasciola spp trong môi trường nước.
- Theo dõi ốc thải Cercaria vào nước trong các đĩa lồng, quan sát sự hoạt động của Cercaria.
- Quan sát hình thái cấu tạo của Cercaria, đo kích thước.
- Theo dõi sự tạo Adolescaria của Cercaria đo kích thước và mô tả. Chỉ tiêu theo dõi:
- Hình thái, kích thước của Cercaria, Adolescaria thời gian tạo thành
Adolescaria.
3.7.2.6 Thí nghiệm 6. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng trong ốc Lymnaea viridis.
- Gây nhiễm trên 50 ốc Limnaea viridis.
- Gây nhiễm Miracidium vào ốc với mật độ gây nhiễm là 8
- Sau 6 – 7 ngày mổ trên 10 ốc tìm Sporocyst.
- Sau 18 ngày mổ ốc tìm Redia mẹ.
- Sau 32 – 34 ngày mổ ốc tìm Redia con. - Sau 58 – 62 ngày mổ ốc tìm Cercaria. Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian phát triển của các giai đoạn ấu trùng trong ốc vật chủ trung gian.
- Hình thái và kích thước các giai đoạn ấu trùng trong ốc vật chủ trung gian.
- Xác định thời gian phát triển của Fasciola spp từ trứng tới
Adolescaria trong điều kiện thực nghiệm.