5. CẤU TRÚC LUẬN VĂN
1.3.5. Các hợp chất khác
Năm 2004, Xu Zhong-Yuan cùng cộng sự tìm ra hợp chất Sucrose OH
OH
18
(đƣờng mía) trong cây cẩu tích có công thức cấu tạo [32]:
Năm 2003, Cheng Qi-hou đã phân lập đƣợc hợp chất có công thức phân tử C10H20O6 từ cây cẩu tích có công thức cấu tạo [8]:
1.4. CƠ SỞ LÍ THUYẾT CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.4.1. Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng
a. Nguyên tắc và điều kiện
Nguyên tắc
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn đƣợc vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) đƣợc để trong một dụng cụ chiết, nhƣ phễu chiết, bình chiết. Hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, môi trƣờng axit. Và Kpb là hằng số nhiệt động. Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, kiểu tĩnh đƣợc ứng dụng nhiều hơn, và sự đơn giản của nó.
Điều kiện
19 bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:
- Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu.
- Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhƣng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết đƣợc triệt để. - Cân bằng chiết nhanh đạt đƣợc và thuận nghịch, để giải chiết đƣợc tốt. - Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha. - Phải chọn môi trƣờng axit, pH, loại axit thích hợp,
- Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình. - Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra đƣợc tốt.
b. Các phương pháp chiết lỏng – lỏng
• Phương pháp chiết tĩnh
Phƣơng pháp chiết này đơn giản, không cần máy móc phức tạp, mà chỉ cần một số phễu chiết (dung tích 100, 250, 500 mL), là có thể tiến hành đƣợc ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay, hay bằng máy lắc nhỏ. Tất nhiên khi phải làm hàng loạt mẫu thì mất nhiều thời gian. Hiện nay ngƣời ta đó cung cấp các hệ chiết đơn giản có 6, 9 hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện chiết cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện.
• Phương pháp chiết dòng chảy liên tục
Trong phƣơng pháp chiết này, khi thực hiện chiết, hai pha lỏng không trộn đƣợc vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) đƣợc bơm liên tục và đi ngƣợc chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết, nhƣ phễu chiết, hay bình chiết liên hoàn đúng kín để chúng tiếp xúc với nhau. Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, cần một pha đứng yờn trong bình. Khi đó, chất phân tích sẽ đƣợc phân bố vào hai dung môi theo tính chất của chúng, để đạt đến trạng thái cõn bằng. Chiết theo cách này hiệu suất cao. Đây là phƣơng pháp chiết đƣợc ứng dụng trong chiết sản xuất công nghệ. Để thực hiện cách chiết này, phải có hệ
20
thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngƣợc chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động ngƣợc chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá trình chiết, để lấy chất đƣợc chiết ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định, mà cân bằng chiết đạt đƣợc.
c. Ưu, nhược điểm và phạm vi ứng dụng
Phƣơng pháp chiết tĩnh đơn giản, dễ thực hiện, đó và đang đƣợc ứng dụng phổ biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách chiết phân tích và làm giàu các chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lƣợng vết. Nhất là tách và làm giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nƣớc, nƣớc thải, nƣớc biển,...
- Các ƣu và nhƣợc điểm chung của kỹ thuật chiết là:
+ Dùng đƣợc cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lƣợng lớn, + Thích hợp cho làm giàu lƣợng nhỏ chất phân tích (có thể 10-50 lần). + Phục vụ cho chiết đƣợc cả các chất vô cơ và các chất hữu cơ.
+ Sản phẩm chiết phù hợp đƣợc cho nhiều phƣơng pháp phân tích.
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
a. Phương pháp sắc ký khí
Lý thuyết chung
Nguyên lý
– Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
– Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
– Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc rắn đƣợc chuyển thành thể bay hơi nhờ một luồng khí trơ làm chất tải, dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì
21
gọi là sắc ký khí – rắn. Chất rắn đƣợc dùng là những chất có tính hấp phụ nhƣ silicagel, than hoạt tính, oxy nhôm, rây phân tử.
– Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí – lỏng. Chất lỏng đƣợc phân tán mỏng nhƣ một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền. Khi chất thử đƣợc khí tải dẫn đi ngang qua lớp chất lỏng, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử với những điều kiện nhiệt độ khác nhau.
– Phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng trong sắc ký khí rất rộng, có thể đến 4000C, nhờ vậy làm tăng ƣu thế của phƣơng pháp sắc ký khí trong việc tách các thành phần ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Cấu tạo
Mẫu đƣợc bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thƣờng là N2) đƣa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ đƣợc hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lƣợt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài đƣợc ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận đƣợc máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Các chất đƣợc xác định nhờ giá trị thời gian lƣu trên sắc ký đồ.
Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản nhƣ sau:
- Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nƣớc cất,…).
- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích.
- Bộ phận tiêm mẫu: Bộ phận tiêm mẫu dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi. Khi đƣa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless). Có 2 cách đƣa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace).
- Cột phân tích: Có 2 loại cột là cột nhồi và cột mao quản.
+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh đƣợc nhồi vào trong cột, cột có đƣờng kính 2-4mm và chiều dài 2-3m.
22
+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh đƣợc phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đƣờng kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m.
– Đầu dò:
Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lƣợng các chất cần phân tích. Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích nhƣ đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID-Flame Ioniation Detetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector), đầu dò NPD (NPD- Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry).
– Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
– In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Ưu, nhược điểm của phương pháp sắc ký khí
- Ƣu điểm
+ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất. + Không cần làm bay hơi mẫu.
+ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột. + Độ nhạy cao nhờ đầu dò.
+ Thể tích mẫu phân tích nhỏ. - Nhƣợc điểm
+ Phƣơng pháp này ít chọn lọc do không loại trừ đƣợc hết đƣợc ảnh hƣởng của nền mẫu.
b. Phương pháp khối phổ (MS)
Lý thuyết chung
– Đặc điểm
+ Phƣơng pháp khối phổ là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng phân tử chất đó. Chất nghiên cứu trƣớc tiên đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích
23
của máy khối phổ kế. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà ngƣời ta phân biệt máy khối phổ ion dƣơng hay âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dƣơng cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
+ Ngƣời ta có thể dùng phƣơng pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Với hợp chất vô cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
+ Đối với hợp chất hữu cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.
- Nguyên lý
+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng.
+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng ứng với lƣợng khối của mỗi ion.
+ Có nhiều loại máy khối phổ với mức độ phân giải (resolution) khác nhau. + Máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách đƣợc hai mảnh ion có khối lƣợng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e)
+ Loại máy có độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao. Loại máy có mức phân giải thấp nhất cũng có thể tách đƣợc các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion có số khối dƣới 500m/e.
- Ứng dụng
+ Xác định các hợp chất chƣa biết bằng cách dựa vào khối lƣợng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó.
+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất.
+ Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nó.
24
c. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phƣơng pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị GC – MS đƣợc cấu tạo thành hai phần: Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật này, các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng, có cách giải quyết đối với một số hóa chất.
Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng kĩ thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành nhƣ y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,...
Nguyên tắc hoạt động
Tƣơng tự nhƣ các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu và bộ phận in dữ liệu phân tích. Trong đó đầu dò là đầu dò khối phổ.
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau, sau đó các ion đƣợc ghi nhận bởi đầu dò.
– Ƣu điểm:
+ Chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ.
+ Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn phức tạp.
+ Kết quả thu nhận đƣợc một cách nhanh chóng (từ 1 đến 100 phút). + Độ chính xác cao.
+ Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp. + Trang thiết bị không quá phức tạp.
25
CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu để nghiên cứu là thân cây cẩu tích Hình 2.1, mẫu tƣơi đƣợc thu hái vào tháng 09/2018 tại xã Hòa Phú, huyện Hòa Vang, thành phố Đà nẵng.
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đƣợc ThS. Bùi Văn Thanh (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học là (Cibotium Barometz) (L) J.Sm thuộc họ lông cu ly Dicksoniaceae.
26
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc
1 n- hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Dichloromethane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc
5 Nƣớc cất Tinh khiết TCCS Trung Quốc
6 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2.1.3. Dụng cụ
- Bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong. - Muỗng, phễu lọc, phễu chiết, chén nung.
- Bếp cách thủy, - Bếp điện, - Bình hút ẩm. - Cân phân tích - Giấy lọc
2.1.4. Các loại máy móc, thiết bị
- Tủ sấy - Lò nung
- Máy cô quay chân không.
2.2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
27
28
2.2.2. Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết thân cây cẩu tích cây cẩu tích
Phần nguyên liệu sau khi thu hái về đem rửa sạch, xắt lát, phơi tự nhiên từ 5kg mẫu tƣơi thu đƣợc 2,98kg mẫu khô, sau đó nghiền thành bột mịn thu đƣợc mẫu nghiên cứu.
Cân 1 kg bột mẫu cho vào túi lọc ngâm với 3 lít metanol ở nhiệt độ phòng trong bình thủy tinh có nắp đậy bảo quản trong tủ hút, thỉnh thoảng lắc, đảo trộn để tăng hiệu quả quá trình chiết. Sau khi ngâm 2 ngày lọc lấy phần dịch methanol bằng giấy lọc, phần cặn mẫu còn lại tiếp lục ngâm lần 2 với 2 lít methanol trong 2 ngày và lọc. Làm tƣơng tự với ngâm lần 3.
Dịch chiết 3 lần gộp lại và tiến hành cô quay chân không ở 600C thu đƣợc 114,25 mL dịch cô đặc methanol ở Hình 2.3.
Hình 2.3. Dịch cô đặc metanol
Hòa tan dịch cô đặc methanol bằng một lƣợng tối thiểu nƣớc cất vào thành dạng hỗn dịch rồi chiết phân bố nối tiếp với lần lƣợt các dung môi là n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.
29
Cao chiết n-hexane: lấy 70 mL dịch chiết methanol chiết lỏng– lỏng, lắc với 50 mL dung môi n-hexane trong khoảng 30 phút bằng phễu chiết, để một thời gian cho tách lớp hoàn toàn. Sau đó thu lại phần dịch nƣớc và dịch chiết n-hexane vào 2 cốc khác nhau. Sử dụng phần dịch nƣớc thu đƣợc tiếp tục chiết lỏng - lỏng với 50mL n-hexane, chiết tƣơng tự nhiều lần cho đến khi màu của dịch chiết n-hexan nhạt dần nhƣ mô tả ở hình 2.4, thử trên mặt kính đồng hồ nếu không còn vết thì dừng lại. Gộp các dịch chiết rồi tiến hành thu hồi dung môi, thu đƣợc cao n-hexan.
Hình 2.4. Quá trình chiết với dung môi n-hexane
Các dịch chiết còn lại ta sử dụng dịch nƣớc thu đƣợc thực hiện tƣơng tự chiết nối tiếp, thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.
Các cao sau khi thu đƣợc, trích một lƣợng nhỏ đem phân tích GC-MS để