Phƣơng pháp phân lập xác định chất sạch từ cao chiết đichloromethane

5. CẤU TRÚC LUẬN VĂN

2.2.3. Phƣơng pháp phân lập xác định chất sạch từ cao chiết đichloromethane

đichloromethane

 Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu phân lập và tinh chế chất trong cao chiết đichloromethane thân cây cẩu tích.

Cao chiết đichloromethane đƣợc tách và tinh chế bằng sắc kí cột thƣờng kết hợp sắc kí bản mỏng silicagel.

Để phân lập và tinh chế chất chúng tôi sử dụng:

- Sắc kí bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 hãng Merck, dày 0.25mm tráng trên nền nhôm.

- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06mm.

- Cột sắc kí là ống thủy tinh có kích thƣớc 2 cm x 80 cm, bên dƣới có van khóa. - Thuốc thử phun lên bản mỏng sử dụng vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy bản mỏng ở nhiệt độ khoảng 1100C.

 Chuẩn bị thuốc thử: Lấy vào bình tam giác 200ml MeOH, thêm 25 mL CH3COOH, làm lạnh hỗn hợp. Sau đó, thêm từ từ 11mL H2SO4 đậm đặc. Cân 1.2 g vanilin. Cho từ từ từng lƣợng nhỏ vanilin vào hỗn hợp trên, vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều.

Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí

Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí bản mỏng với các bƣớc sau:

+ Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu trong dung môi CHCl3.

+ Chuẩn bị 5 tấm bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.

+ Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau: n- hexane/EtOAc (với các tỉ lệ 95:5, 90:10, 85:15), CHCl3/MeOH (99:1), CHCl3/CH3COCH3 (8:2). Tiếp theo hiện hình bằng thuốc thử. Bản mỏng nào có sự tách vệt rõ ràng, các vệt nằm trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng thì hệ dung môi tƣơng ứng đó là thích hợp để chạy cột sắc kí.

31

Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n-hexane/EtOAc.

Chuẩn bị cột sắc kí

Cố định cột trên giá. Cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng.

Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nhồi vào cột sắc kí theo phƣơng pháp nhồi sệt.

Cho hệ dung môi n–hexane: EtOAc = 95 : 5 vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí bản mỏng).

Lấy 150 gam silicagel cho từ từ từng lƣợng nhỏ vào cốc đựng hệ dung môi trên vừa khuấy đều để đuổi hết bọt khí, thu đƣợc một hỗn hợp sệt đồng nhất để nhồi vào cột sắc kí.

Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.

Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc đồng nhất. Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột. Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng.

 Nạp mẫu vào cột

Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khô.

5.012g cao đichloromethane hòa tan vừa đủ bằng CHCl3 trong bình cầu, thêm 5 gam silicagel, quay cất đến khô để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.

Mẫu khô đã đƣợc làm tơi mịn đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phƣơng pháp khô thì lƣợng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lƣợng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên

32

bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ƣớt đều dung môi, không có bọt khí. Cho từng lƣợng nhỏ dung môi chạy cột vào rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột

Cao chiết đichloromethane đƣợc tách thô thành 5 phân đoạn, HC1-HC5, bằng cột silica gel, rửa giải gradient n-hexane-ethylacetate (50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 2,5/1, 1/1, v/v, 7,5 lít). Phân đoạn HC5 (3,5 g) đƣợc tách tiếp bằng cột silica gel, rửa giải bằng hệ n-hexane-ethylacetate (3:1, v/v, 1,75 lít) thành 8 phân đoạn, HC5A- HC5H. Tinh chế phân đoạn HC5B (45 mg) bằng dung môi acetone thu đƣợc hợp chất TRANG (15 mg).

Chất TRANG đem đo phổ 1H-NMR (MeOD, 500 Hz), phổ 13C-NMR(CDCl3, 125 MHz), phổ DEPT, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC thu đƣợc các kết quả cho ở chƣơng 3.

Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất có trong cao chiết đichloromethane, các phƣơng pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký cột thƣờng silicagel Merck 63-200 nm, sắc kí khí lỏng với các dung môi và hệ dung môi thích hợp) đã đƣợc sử dụng phối hợp cùng các phƣơng pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.

33

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ KHỐI LƢỢNG CAO CHIẾT THU ĐƢỢC

Tổng lƣợng dịch cô đặc methanol thu đƣợc sau khi đuổi dung môi là 114,25 mL.

Bảng 3.1. Khối lượng cao thu được sau khi cô quay các dịch chiết

Dung môi Khối lƣợng cao chiết (gam) % tổng cao n-hexane 10,947 9,61 Dichloromethane 9,883 8,65 Chloroform 6,035 5,28 ethyl acetate 8,473 7,42 Nhận xét:

Khối lƣợng cao chiết từ tổng cao methanol với dung môi n– hexane là lớn nhất 10,947g (9,61%).

3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT 3.2.1. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 3.2.1. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane

Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học có trong dịch chiết n-hexane thân cây cẩu tích đƣợc thể hiện ở Hình 3.1.

34

Hình 3.1. Sắc ký đồGC của dịch chiết n–hexane từthân cây cẩu tích

Bảng 3.2. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane thân cây cẩu tích

STT RT

(phút) Tên Area (%)

1 21,066 Paeonol 0,5

35

3 28,188 Pentadecylic acid 0,39

4 28,927 Palmitic acid, methyl ester 2,52

5 31,018 Linoleic acid, methyl ester 2,89

6 31,176 Linolenic acid, methyl ester 0,93

7 35,365 Beta-Monolinolein 3,59 8 36,797 Beta-Tocopherol 0,19 9 36,971 A’-Neogammacer-22 (29) –ene 0,46 10 37,328 Vitamin E 0,81 11 38,462 Campesterol 3,86 12 38,606 Stigmasterol 1,1 13 39,155 Gamma-Sitosterol 13,65

14 39,377 (Z)-Stigmasta-5,24 (28)-dien-3 beta-ol 0,14

15 39,952 Beta-Amyrin 0,17

16 40,077 Cycloartenol 0,75

17 40,260 (+-)-Alpha-Tocopherol 1,51

18 40,815 Gamma-Sitostenone 0,29

 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phƣơng pháp GC–MS đã định danh đƣợc 18 cấu tử trong dịch chiết n–hexane từ thân cây cẩu tích. Các cấu tử có hàm lƣợng cao là Gamma-Sitosterol (13,65%), Campesterol (3,86%), Beta- Monolinolein (3,59%), Linoleic acid, methyl ester (2,89%). Trong đó một số cấu tử có hoạt tính sinh học đặc biệt nhƣ:

- Paenol: Hoạt chất paeonol có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ phổi LLC và LU-1 với các giá trị IC50 lần lƣợt là 49,12 ug/mL, 52,96 ug/mL.

- Myristic acid: Dùng làm chất hoạt động bề mặt, có khả năng làm sạch và khả năng nhũ hóa.

- Linoleic acid: Giảm cholesterol LDL, cải thiện huyết áp và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Axit linoleic cũng góp phần tạo ra prostaglandin, kích thích

36

lƣu thông qua giãn mạch và tăng cƣờng cơ chế phòng thủ tự nhiên của cơ thể, hỗ trợ ức chế viêm, giúp điều trị chàm và dị ứng da. Duy trì sự hình thành xƣơng và có thể giúp giảm nguy cơ loãng xƣơng, gãy xƣơng.

- Linolenic acid: Giúp làm hạ huyết áp. Chữa bệnh mỡ máu, bệnh tim mạch, hội chứng chuyển hóa, đau do biến chứng thần kinh đái tháo đƣờng, rối loạn tăng động giảm chú ý (ADHD). Trầm cảm sau sinh, chứng mệt mỏi kinh niên.

- Vitamin E, (+-)-Alpha-Tocopherol: Thƣờng có ba loại vitamin E: α, β, δ – tocopherol, nhƣng chỉ có α – tocopherol là có hoạt tính mạnh nhất.

+ Tác dụng chống oxy hóa mạnh: thu giữ các gốc tự do đƣợc sinh ra trong quá trình chuyển hóa.

+ Bảo vệ đƣợc các acid béo của màng tế bào khỏi bị hƣ hỏng bởi các gốc tự do cũng nhƣ các hợp chất dễ oxy hóa khác.

+ Chống xơ vữa động mạch do làm giảm sự oxy hóa các protein tan trong mỡ mà các protein này tham gia vào quá trình tắc nghẽn động mạch.

+ Vitamin E tham gia vào quá trình điều hòa sinh sản. Khi thiếu vitamin E, quá trình tạo phôi của cơ thể bị ảnh hƣởng, các cơ quan sinh sản của cơ thể bị thoái hóa.

+ Vitamin E tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử trong các phản ứng oxy hóa khử và liên quan với dự trữ năng lƣợng đƣợc giải phóng trong các quá trình đó.

+ Vitamin E cần thiết cho quá trình phosphoryl hóa, oxy hóa creatin ở cơ, ảnh hƣởng tới cấu trúc và chức năng của cơ, tủy sống và một số mô khác.

- Stigmasterol: Giảm đau. Chống lão hóa, chống viêm khớp, xơ vữa động mạch. Chống ung thƣ. Chống co giật. Chống đái tháo đƣờng. Chống bênh mất trí nhớ.

- Campesterol: Thuộc nhóm phytosterol, có tác dụng giảm nguy cơ bệnh tim mạch và viêm, giúp phòng chống hạ đƣờng huyết, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim và

37

làm giảm cholesterol, tăng cƣờng hoạt động chống oxy hóa.

3.2.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết dichloromethane

Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học có trong dịch chiết dichloromethane từ thân cây cẩu tích đƣợc thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Sắc ký đồGC của dịch chiết dichloromethane từthân cây cẩu tích

Bảng 3.3. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết dichloromethane từ thân cây cẩu tích

STT RT

(phút) Tên Area (%)

38

2 15.944 Coumaran 0.34

3 16.081 Ethriol 0.32

4 20.483 Trans-Cinnamic acid 0.17

5 21.070 Paeonol 0.39

6 28.933 Palmitic acid, methyl ester 2.72

7 31.023 Linoleic acid, methyl ester 3.31

8 31.179 Linolenic acid, methyl ester 1.18

9 31.832 Linoleic acid 5.60 10 35.367 Beta-Monolinolein 3.37 11 35.659 Alpha-Tocospiro B 0.30 12 35.757 Alpha-Tocospiro A 0.25 13 36.972 A’-Neogammacer-22(29)-ene 0.51 14 37.191 Stigmastan-3,5-diene 0.09 15 37.330 Vitamin E 0.88 16 38.464 Campesterol 3.83 17 38.607 Stigmasterol 1.07 18 39.160 Gamma-Sitosterol 13.12 19 40.076 Cycloartenol 0.69 20 40.263 dl-alpha-Tocopherol 1.33 21 40.405 24-Methylenecycloartanol 0.62 22 40.819 Gamma-Sitostenone 0.27

 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.3 cho thấy phƣơng pháp GC–MS đã định danh đƣợc 22 cấu tử trong dịch chiết dichlomethane từ thân cây cẩu tích. Các cấu tử có hàm lƣợng cao là Gamma-Sitosterol (13,12%), Linoleic acid (5,60%), Campesterol (3,83%), Beta-Mônlinolein (3,37%), Linoleic acid, Methyl ester (3,31%). Trong đó có một số cấu tử có hoạt tính sinh học tốt nhƣ: Paenol, Linoleic acid, Linolenic acid,

39

Vitamin E. Ngoài ra cấu tử Alpha-Tocospiro là chất chống oxi hóa, 24- Methylenecycloartanol có hoạt tính kháng viêm. Coumaran và Catechol có hoạt tính chống oxi hóa.

3.2.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform

Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học có trong dịch chiết chloroform từ thân cây cẩu tích đƣợc thể hiện ở hình 3.3.

40

Bảng 3.4.Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform từ thân cây cẩu tích

STT RT

(phút) Tên MW Area (%)

1 15.944 Coumaran 0.40

2 16.201 Ethriol 0.77

3 31.019 Linoleic acid, methyl ester 2.29

4 31.178 Linolenic acid, methyl ester 0.65

5 33.666 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxyacetophenone 3.11 6 35.366 Beta-Monolinolein 2.05 7 37.329 Vitamin E 0.63 8 38.465 Campesterol 2.72 9 38.608 Stigmasterol 0.79 10 39.164 Gamma-Stosterol 10.05

 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy phƣơng pháp GC–MS đã định danh đƣợc 10 cấu tử t6ong dịch chiết cloroform từ thân cây cẩu tích. Các cấu tử có hàm lƣợng cao là Gamma-Stosterol (10,05%), 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxyacetophenone (3,11%), Campesterol (2,72%). Trong đó có một số cấu tử có hoạt tính sinh học tốt nhƣ: Linoleic acid, Linolenic acid, Vitamin E.

3.2.4. Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate

Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học có trong dịch chiết ethyl acetate từ thân cây cẩu tích thể đƣợc thể hiện ở hình 3.4.

41

42

Bảng 3.5. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate từ thân cây cẩu tích

STT RT (phút) Tên MW Area (%) 1 15.522 Catechol 2.19 2 15.934 Coumaran 5.27 3 16.157 Ethriol 1.30 4 26.247 Phloretic acid 2.14

5 29.839 (E) –p-Coumaric acid 5.70

6 39.070 Beta-Stosterol 1.50

 Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy phƣơng pháp GC–MS đã định danh đƣợc 6 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ thân cây cẩu tích. Các cấu tử có hàm lƣợng cao là (E) –p-Coumaric acid (5,70%), Coumaran (5,27%), catechol (2,19%), Phloretic acid (2,14%). Trong đó cấu tử (E) –p-Coumaric acid có hoạt tính chống oxi hóa mạnh, có khả năng kháng 4 tế bào ung thƣ là ung thƣ biểu mô, ung thƣ gan, ung thƣ phổi và ung thƣ vú.

3.3. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DANG CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT DICHLOMETHANE

Đƣa cặn chiết đƣợc bằng dichlomethane lên cột sắc kí với chất hấp phụ silicagel và đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi clorofom – Metanol tỉ lệ (99:1) thu đƣợc chất vô định hình, đem kết tinh lại trong etylaxetat đƣợc tinh thể không màu, hình kim, có khối lƣợng 30,5mg, Rf= 0,58 trong hệ dung môi chlorofom - metanol (9:1). Phổ 1H–NMR và 13C – NMR của hợp chất TRANG đƣợc thể hiện ở Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7 và Hình 3.8.

43

44

45

46

47 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR Số TT C δH (ppm), J (HZ), H→C δC (ppm) 1 214,74 s 2 46,0 s 3 2,82 s 39,58 t 4 151,44s 5 131,94s 6 138,57s 7 132,78s 8 138,57s 9 130,14s 10 1,18 (3H,s) 25,94 q 11 1,18 (3H,s) 25,94 q 12 2,33 (3H,s) 13,34q 13 2,58 (3H,s) 13,02q 14 3,00 (2H,J=8Hz) 33,45t 15 3,60 (2H,J=8Hz) 61,87t

Phân tích phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR nhận thấy có các đặc điểm sau: Trong phân tử của chất TRANG có 15 nguyên tử cacbon trong đó có 8 cacbon bậc 4, có 3 nhóm metylen và 4 nhóm CH3. Trong số cacbon bậc 4 có một nguyên tử cộng hƣởng ở trƣờng yếu δC ở 214,74ppm đặc trƣng cho cacbon trong nhóm C=O. Có 6 nguyên tử cacbon đặc trƣng cho cacbon của vòng thơm cộng hƣởng ở vùng trƣờng yếu với các độ chuyển dịch hóa học δC tƣơng ứng bằng 151,44ppm (C-4), 131,94ppm (C-5), 138,57ppm (C-6), 132,78ppm (C-7), 137,78ppm (C-8) và 130,14ppm (C-9). Có 1 nhóm CH2 cho tín hiệu δC ở 61,87ppm đặc trƣng cho cacbon liên kết với oxi trong các

48

ancol. Phổ HSQC cho biết (2H) tƣơng ứng trong nhóm này cho δH ở 3,60ppm (2H) và tƣơng tác spin-spin J=8Hz. Có 1 nhóm CH2 cộng hƣởng ở trƣờng mạnh hơn với δC bằng 33,45ppm và δH tƣơng ứng bằng 3,00ppm (2H) với J=8Hz cho thấy đây là nhóm CH2 đứng ngay cạnh nhóm CH2 liên kết với OH, còn nhóm CH2 thứ 3 cũng cộng hƣởng ở vùng trƣờng mạnh δC bằng 39,58ppm và δH tƣơng ứng bằng 2,82ppm (2H) có dạng singlet chứng tỏ đó là 2 nguyên tử hiđro tƣơng đƣơng nhau và đứng cạnh các nguyên tử cacbon bậc 4.

Trong số 4 nhóm CH3 có 2 nhóm CH3 tƣơng đƣơng nhau với δH tƣơng ứng bằng 1,18ppm (6H) cho tƣơng tác xa với C1, C2, C3 và δC tƣơng ứng bằng 25,94ppm. 2 nhóm CH3 còn lại cho các tín hiệu cộng hƣởng thứ tự ở δC bằng 13,02ppm và 13,34ppm với các δH tƣơng ứng bằng 2,33ppm (3H,s) và 2,58ppm (3H, s).

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của chất TRANG

Onitin [25] ACD Chất TRANG

Số TT C δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 211,4s 213,57 214,74 s 2 44,8s 43,43 46,0 s 3 2,76 38,3 t 3,01 39,78 2,82 s 39,58 t 4 149,9s 150,32 151,44s 5 130,1s 134,43 131,94s 6 136,9s 138,29 138,57s 7 130,5s 133,18 132,78s 8 136,9s 131,95 138,57s

49 9 127,9s 137,37 130,14s 10 1,09 (3H,s) 25,4q 1,20 25,50 1,18 (3H,s) 25,94 q 11 1,09 (3H,s) 1,20 25,50 1,18 (3H,s) 25,94 q 12 2,24 (3H,s) 12,7q 2,11 11,99 2,33 (3H,s) 13,34q 13 2,50 (3H,s) 12,6q 2,56 13,93 2,58 (3H,s) 13,02 q 14 2,83 32,6t 3,01 33,03 3,00 (2H,J=8Hz) 33,45t 15 3,42 59,9t 3,83 61,13 3,60 (2H,J=8Hz) 61,87t

Dựa trên các phổ NMR, so sánh với các số liệu đã đƣợc công bố trên tạp chí [25] và số liệu tính toán ACD/CNMR ở Bảng 3.7, chúng tôi nhận thấy chất TRANG tƣơng tự nhƣ chất onitin đã đƣợc các tác giả công bố vì vậy có thể quy kết chất TRANG là một serquytecpen có công thức phân tử C15H20O3 với công thức cấu tạo