5. CẤU TRÚC LUẬN VĂN
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
a. Phương pháp sắc ký khí
Lý thuyết chung
Nguyên lý
– Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
– Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
– Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc rắn đƣợc chuyển thành thể bay hơi nhờ một luồng khí trơ làm chất tải, dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì
21
gọi là sắc ký khí – rắn. Chất rắn đƣợc dùng là những chất có tính hấp phụ nhƣ silicagel, than hoạt tính, oxy nhôm, rây phân tử.
– Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí – lỏng. Chất lỏng đƣợc phân tán mỏng nhƣ một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền. Khi chất thử đƣợc khí tải dẫn đi ngang qua lớp chất lỏng, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử với những điều kiện nhiệt độ khác nhau.
– Phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng trong sắc ký khí rất rộng, có thể đến 4000C, nhờ vậy làm tăng ƣu thế của phƣơng pháp sắc ký khí trong việc tách các thành phần ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Cấu tạo
Mẫu đƣợc bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thƣờng là N2) đƣa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ đƣợc hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lƣợt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài đƣợc ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận đƣợc máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Các chất đƣợc xác định nhờ giá trị thời gian lƣu trên sắc ký đồ.
Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản nhƣ sau:
- Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nƣớc cất,…).
- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích.
- Bộ phận tiêm mẫu: Bộ phận tiêm mẫu dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi. Khi đƣa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless). Có 2 cách đƣa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace).
- Cột phân tích: Có 2 loại cột là cột nhồi và cột mao quản.
+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh đƣợc nhồi vào trong cột, cột có đƣờng kính 2-4mm và chiều dài 2-3m.
22
+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh đƣợc phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đƣờng kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m.
– Đầu dò:
Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lƣợng các chất cần phân tích. Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích nhƣ đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID-Flame Ioniation Detetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector), đầu dò NPD (NPD- Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry).
– Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
– In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Ưu, nhược điểm của phương pháp sắc ký khí
- Ƣu điểm
+ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất. + Không cần làm bay hơi mẫu.
+ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột. + Độ nhạy cao nhờ đầu dò.
+ Thể tích mẫu phân tích nhỏ. - Nhƣợc điểm
+ Phƣơng pháp này ít chọn lọc do không loại trừ đƣợc hết đƣợc ảnh hƣởng của nền mẫu.
b. Phương pháp khối phổ (MS)
Lý thuyết chung
– Đặc điểm
+ Phƣơng pháp khối phổ là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng phân tử chất đó. Chất nghiên cứu trƣớc tiên đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích
23
của máy khối phổ kế. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà ngƣời ta phân biệt máy khối phổ ion dƣơng hay âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dƣơng cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
+ Ngƣời ta có thể dùng phƣơng pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Với hợp chất vô cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
+ Đối với hợp chất hữu cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.
- Nguyên lý
+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng.
+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng ứng với lƣợng khối của mỗi ion.
+ Có nhiều loại máy khối phổ với mức độ phân giải (resolution) khác nhau. + Máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách đƣợc hai mảnh ion có khối lƣợng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e)
+ Loại máy có độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao. Loại máy có mức phân giải thấp nhất cũng có thể tách đƣợc các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion có số khối dƣới 500m/e.
- Ứng dụng
+ Xác định các hợp chất chƣa biết bằng cách dựa vào khối lƣợng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó.
+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất.
+ Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nó.
24
c. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phƣơng pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị GC – MS đƣợc cấu tạo thành hai phần: Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật này, các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng, có cách giải quyết đối với một số hóa chất.
Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng kĩ thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành nhƣ y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,...
Nguyên tắc hoạt động
Tƣơng tự nhƣ các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu và bộ phận in dữ liệu phân tích. Trong đó đầu dò là đầu dò khối phổ.
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau, sau đó các ion đƣợc ghi nhận bởi đầu dò.
– Ƣu điểm:
+ Chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ.
+ Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn phức tạp.
+ Kết quả thu nhận đƣợc một cách nhanh chóng (từ 1 đến 100 phút). + Độ chính xác cao.
+ Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp. + Trang thiết bị không quá phức tạp.
25
CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu để nghiên cứu là thân cây cẩu tích Hình 2.1, mẫu tƣơi đƣợc thu hái vào tháng 09/2018 tại xã Hòa Phú, huyện Hòa Vang, thành phố Đà nẵng.
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đƣợc ThS. Bùi Văn Thanh (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học là (Cibotium Barometz) (L) J.Sm thuộc họ lông cu ly Dicksoniaceae.
26
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc
1 n- hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Dichloromethane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc
5 Nƣớc cất Tinh khiết TCCS Trung Quốc
6 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2.1.3. Dụng cụ
- Bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong. - Muỗng, phễu lọc, phễu chiết, chén nung.
- Bếp cách thủy, - Bếp điện, - Bình hút ẩm. - Cân phân tích - Giấy lọc
2.1.4. Các loại máy móc, thiết bị
- Tủ sấy - Lò nung
- Máy cô quay chân không.
2.2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
27
28
2.2.2. Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết thân cây cẩu tích cây cẩu tích
Phần nguyên liệu sau khi thu hái về đem rửa sạch, xắt lát, phơi tự nhiên từ 5kg mẫu tƣơi thu đƣợc 2,98kg mẫu khô, sau đó nghiền thành bột mịn thu đƣợc mẫu nghiên cứu.
Cân 1 kg bột mẫu cho vào túi lọc ngâm với 3 lít metanol ở nhiệt độ phòng trong bình thủy tinh có nắp đậy bảo quản trong tủ hút, thỉnh thoảng lắc, đảo trộn để tăng hiệu quả quá trình chiết. Sau khi ngâm 2 ngày lọc lấy phần dịch methanol bằng giấy lọc, phần cặn mẫu còn lại tiếp lục ngâm lần 2 với 2 lít methanol trong 2 ngày và lọc. Làm tƣơng tự với ngâm lần 3.
Dịch chiết 3 lần gộp lại và tiến hành cô quay chân không ở 600C thu đƣợc 114,25 mL dịch cô đặc methanol ở Hình 2.3.
Hình 2.3. Dịch cô đặc metanol
Hòa tan dịch cô đặc methanol bằng một lƣợng tối thiểu nƣớc cất vào thành dạng hỗn dịch rồi chiết phân bố nối tiếp với lần lƣợt các dung môi là n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.
29
Cao chiết n-hexane: lấy 70 mL dịch chiết methanol chiết lỏng– lỏng, lắc với 50 mL dung môi n-hexane trong khoảng 30 phút bằng phễu chiết, để một thời gian cho tách lớp hoàn toàn. Sau đó thu lại phần dịch nƣớc và dịch chiết n-hexane vào 2 cốc khác nhau. Sử dụng phần dịch nƣớc thu đƣợc tiếp tục chiết lỏng - lỏng với 50mL n-hexane, chiết tƣơng tự nhiều lần cho đến khi màu của dịch chiết n-hexan nhạt dần nhƣ mô tả ở hình 2.4, thử trên mặt kính đồng hồ nếu không còn vết thì dừng lại. Gộp các dịch chiết rồi tiến hành thu hồi dung môi, thu đƣợc cao n-hexan.
Hình 2.4. Quá trình chiết với dung môi n-hexane
Các dịch chiết còn lại ta sử dụng dịch nƣớc thu đƣợc thực hiện tƣơng tự chiết nối tiếp, thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.
Các cao sau khi thu đƣợc, trích một lƣợng nhỏ đem phân tích GC-MS để xác định thành phần và hàm lƣợng các cấu tử có trong mỗi cao chiết.
– Thiết bị: máy đo sắc ký khí ghép phổ GC-MS Agilent.
– Đo tại trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng 2, 02 Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
30
2.2.3. Phƣơng pháp phân lập xác định chất sạch từ cao chiết đichloromethane đichloromethane
Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu phân lập và tinh chế chất trong cao chiết đichloromethane thân cây cẩu tích.
Cao chiết đichloromethane đƣợc tách và tinh chế bằng sắc kí cột thƣờng kết hợp sắc kí bản mỏng silicagel.
Để phân lập và tinh chế chất chúng tôi sử dụng:
- Sắc kí bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 hãng Merck, dày 0.25mm tráng trên nền nhôm.
- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06mm.
- Cột sắc kí là ống thủy tinh có kích thƣớc 2 cm x 80 cm, bên dƣới có van khóa. - Thuốc thử phun lên bản mỏng sử dụng vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy bản mỏng ở nhiệt độ khoảng 1100C.
Chuẩn bị thuốc thử: Lấy vào bình tam giác 200ml MeOH, thêm 25 mL CH3COOH, làm lạnh hỗn hợp. Sau đó, thêm từ từ 11mL H2SO4 đậm đặc. Cân 1.2 g vanilin. Cho từ từ từng lƣợng nhỏ vanilin vào hỗn hợp trên, vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều.
Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí bản mỏng với các bƣớc sau:
+ Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu trong dung môi CHCl3.
+ Chuẩn bị 5 tấm bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
+ Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau: n- hexane/EtOAc (với các tỉ lệ 95:5, 90:10, 85:15), CHCl3/MeOH (99:1), CHCl3/CH3COCH3 (8:2). Tiếp theo hiện hình bằng thuốc thử. Bản mỏng nào có sự tách vệt rõ ràng, các vệt nằm trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng thì hệ dung môi tƣơng ứng đó là thích hợp để chạy cột sắc kí.
31
Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n-hexane/EtOAc.
Chuẩn bị cột sắc kí
Cố định cột trên giá. Cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng.
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nhồi vào cột sắc kí theo phƣơng pháp nhồi sệt.
Cho hệ dung môi n–hexane: EtOAc = 95 : 5 vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí bản mỏng).
Lấy 150 gam silicagel cho từ từ từng lƣợng nhỏ vào cốc đựng hệ dung môi trên vừa khuấy đều để đuổi hết bọt khí, thu đƣợc một hỗn hợp sệt đồng nhất để nhồi vào cột sắc kí.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc đồng nhất. Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột. Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng.
Nạp mẫu vào cột
Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khô.
5.012g cao đichloromethane hòa tan vừa đủ bằng CHCl3 trong bình cầu, thêm 5 gam silicagel, quay cất đến khô để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
Mẫu khô đã đƣợc làm tơi mịn đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phƣơng pháp khô thì lƣợng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lƣợng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên
32
bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ƣớt đều dung môi, không có bọt khí. Cho từng lƣợng nhỏ dung môi chạy cột vào rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột
Cao chiết đichloromethane đƣợc tách thô thành 5 phân đoạn, HC1-HC5, bằng cột silica gel, rửa giải gradient n-hexane-ethylacetate (50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 2,5/1, 1/1, v/v, 7,5 lít). Phân đoạn HC5 (3,5 g) đƣợc tách tiếp bằng cột silica gel, rửa giải bằng hệ n-hexane-ethylacetate (3:1, v/v, 1,75 lít) thành 8 phân đoạn, HC5A-