5. Cấu trúc luận văn
2.3.2. Chạy cột sắc kí phần cao EtOAc
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát phân lập các chất từ cao EtOAc
SKC silicagel n-hexan: EtOAc (0-100% EtOAc) Thu được 33 phân đoạn NWE 39g NWE.32.5 613mg NWE.31 353mg NWE.31.7 200mg NWE.CS2 20mg NWE.32 3g NWE.CS1 25mg SKC silicagel CH2Cl2: MeOH (95:5) Thu được 8 phân
đoạn
SKC silicagel CH2Cl2: MeOH
(95:5) Thu được 5 phân
đoạn SKC silicagel CH2Cl2: MeOH (95:5) Thu được 10 phân đoạn SKC silicagel CH2Cl2: MeOH (95:5) Thu được 4 phân
đoạn
Phần cao EtOAc (39g) được hồ tan hồn tồn trong dung mơi EtOAc trong bình cầu, sau khi chấm bản mỏng để tìm hệ dung mơi thích hợp, thêm silicagel, sau đĩ cất quay dưới áp suất thấp đến khơ hồn tồn sao cho chất được gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ trước khi đưa vào cột sắc kí.
Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho hệ dung mơi n–hexan:EtOAc = 95:5 vào ca nhựa (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lượng silicagel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) lấy khoảng 975 gam cho vào ca nhựa trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Cho một lượng nhỏ bơng vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng). - Silicagel được cho vào cột ở dạng sệt.
Nạp mẫu vào cột
- Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khơ.
- Mẫu khơ đã được làm tơi mịn được cho vào cột sắc kí từ từ thơng qua phễu sau khi đã khố cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khơ thì lượng dung mơi phải vừa đủ, khơng nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung mơi, khơng cĩ bọt khí.
Chạy cột Silicagel với hệ dung mơi n–hexan – EtOAc với độ phân cực tăng dần (hệ dung mơi ban đầu n–hexan:EtOAc = 95:5), thu được 33 phân đoạn kí hiệu từ NWE.1 đến NWE.33
Các phân đoạn được kiểm tra trên sắc kí bản mỏng cho thấy phân đoạn
NWE.31 (353mg) và NWE.32 (3g) cho các vệt rõ ràng. Do vậy 2 phân đoạn này được chọn để tiếp tục tinh chế.
Phân đoạn NWE.31 (353mg) được hịa tan hồn tồn trong EtOAc rồi thêm khoảng 0,9g silicagel, đem cơ quay đến khơ. Nghiền thành bột mịn mẫu
đã gắn đều trên silicagel. Nạp mẫu lên cột silicagel, giải hấp với dung mơi ban đầu là CH2Cl2:MeOH (95:5), tăng dần độ phân cực của dung mơi đến CH2Cl2:MeOH (7:3), sau đĩ xả cột với MeOH thu được 8 phân đoạn. Phân đoạn NWE.31.7 (200mg) được tiếp tục tinh chế trên cột silicagel với dung mơi chạy cột ban đầu là CH2Cl2:MeOH (95:5), tăng dần độ phân cực của dung mơi lên CH2Cl2:MeOH (7:3) sau đĩ xả cột với MeOH thu được 5 phân đoạn. Cất loại dung mơi dưới áp suất giảm phân đoạn NWE.31.7.4 (25mg), sau đĩ chấm bản mỏng với hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH (95:5) thì thấy chỉ xuất hiện 1 vệt, chất hiện UV và hiện thuốc thử Vanilin màu xám đen. Chất này được kí hiệu là NWE.CS1.
Phân đoạn NWE.32 (3g) được hịa tan hồn tồn trong EtOAc rồi thêm khoảng 7,5g silicagel, cơ quay đến khơ. Mẫu đã gắn đều trên silicagel được nghiền thành bột mịn. Sau đĩ nạp mẫu lên cột silicagel, giải hấp với hệ dung mơi ban đầu là CH2Cl2:MeOH (95:5), sau đĩ tăng dần độ phân cực lên CH2Cl2:MeOH (7:3), cuối cùng rửa cột với MeOH thu được 10 phân đoạn, (NWE.32.1 – NWE.32.10). Phân đoạn NWE.32.5 (615mg) cho vệt rõ ràng và tách biệt nhau trên bản mỏng phân tích, được tiếp tục tinh chế trên cột silicagel với hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH gradient thu được 4 phân đoạn. Kiểm tra phân đoạn NWE.32.5.3 trên bản mỏng phân tích với hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH (9:1) cho thấy chỉ cĩ 1 vệt duy nhất dưới đèn UV và hiện màu xám đen với thuốc thử Vanilin/H2SO4. Phân đoạn này được cơ quay loại dung mơi thu được 20mg và được kí hiệu là chất NWE.CS2.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN