CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.3.5. Chạy sắc kí bản mỏng dịch tan chất rắn sau khi tinh chế
a. Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng mua trên thị trường đã được tráng silicagen có kích thước 20 cm x 20 cm. Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ 1 cm x 8 cm để phân tích nhanh. Dùng bút chì vót nhọn vách mức xuất phát cách mét dưới bản mỏng 1,5cm, mức tiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm
b. Lựa chọn dung môi
Lựa chọn hệ dung môi Cloroform/Butanol với các tỷ lệ được thể hiện trong Bảng 2.1.
c. Chuẩn bị mao quản
Mao quản có chiều dài 7cm, đường kính 1,5 mm – 1,6mm, mao quản dùng để hút dung dịch chấm lên bản mỏng yêu cầu bé hơn, vì kích thước này quá lớn để lấy mẫu, các vết sẽ rất to, làm kết quả không chính xác. Để có đầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: Hai tay cầm hai đầu ống, đặt phần giữa ống lên ngọn lữa đèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn đều ống đến khi đoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, đưa ống ra khỏi ngọn lửa, dùng tay kéo hai đầu ống đang nóng ra hai phía. Khi đó phần ống mao quản ở giữa trở nên nhỏ và hẹp hơn. Ống mao quản cứng lại, bẻ cong làm đôi ở chỗ đã được kéo nhỏ.
d. Đưa mẫu lên bản mỏng
Hòa tan một ít tinh thể chất rắn thu được bằng 1ml methanol. Dùng mao quản đã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu cà chua chín,
lực mao dẫn sẽ hút dung dịch vào mao quản, kho dung dịch lên khoảng 6mm thì lấy ra. Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng tại vạch xuất phát. Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật nhanh để mẫu thấm vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ. Để khô dung môi ngoài không khí khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên ta được một bản mỏng có chấm mẫu dung dịch tan chất rắn dùng để chạy sắc kí.
e. Chuẩn bị bình chạy sắc kí
Bình hút ẩm đã rửa sạch, phơi khô. Đặt cốc 250ml vào giữa bình. Cho dung môi giải li vào cốc, dung môi Cloroform : Butanol trọn theo tỷ lệ 1:1, sau đó dùng pipet hút khoảng 30ml cho vào cốc, để yên 5-10 phút để bão hòa dung môi trong bình.
Bản mỏng được cầm thẳng đúng và được nhúng vào cốc chứa dung môi trong bình, khi nhúng phải cẩn thận để hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thành cống, sau đó nhẹ nhàng để bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng một góc khoảng 15 độ. Vị trí vết chấm dịch tan chất rắn nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5 cm.
Đậy nắp bình thật kín, có thoa vazolin để đảm bảo không có không khí lọt vào và khi mở nắp cũng dễ dàng, theo dõi quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách tuyến dung môi 1 cm thì lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút.
f. Hiện các vệt chấm sau khi triển khai
Cho một ít tinh thể iốt để trong một đĩa thủy tinh, cho vào đáy của một bình hút ẩm khác. Đưa bản mỏng vào bình hút ẩm chứa iốt, hơi iot tỏa ra chiếm hết lọ, các vết sẽ hiện hình rõ trên bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, đậy nắp bình hút ẩm lại, dùng bút chì đánh dấu tâm vệt. Xác định Rf.
Tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với tỷ lệ các dung môi còn lại đã được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Tỷ lệ hệ dung môi Cloroform/Butanol chạy sắc kí bản mỏng dịch tan chất rắn
Dung môi hòa tan mẫu Hệ dung môi
chạy sắc kí Tỷ lệ (ml/ml)
Methanol Cloroform : Butanol
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5