4. Phương pháp nghiên cứu
1.2. GIỚI THIỆU AXIT HYDROXYCITRIC (HCA)
1.2.1. Nguồn gốc (-)-HCA
(-)-HCA được tìm thấy trong vỏ quả của một vài loài bứa, bao gồm tai chua (G. cowa), G. cambogia, G. indica và G. atroViridis. Các loài này mọc nhiều tại lục địa Ấn Độ và phía tây Sri Lanka.
1.2.2. Hóa học của (-)-HCA
a. Sự khám phá (-)-HCA
Vỏ quả G. cambogia sấy khô phổ biến xem như là “me Malabar” được sử dụng rộng rãi khắp vùng biển phía đông Ấn Độ với mục đích nấu nướng và trong thương mại sử dụng như “Colombo curing” để muối cá. Axit hữu cơ
trong quả bứa có mục đích kìm hãm có hiệu quả sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường nước mắm do pH thấp. Trước nay các axit hữu cơ này đã bị
xác định nhầm là axit me và axit chanh. Dung dịch nước chiết quả cho thấy rõ 02 axit thương phẩm bằng phương pháp sắc ký giấy sử dụng các dung môi khác nhau, mà nó rất gần giống axit tactaric và citric, nhưng nó luôn có ý nghĩa khi sự khác biệt nhỏ giá trị của Rf trong các hệ dung môi. Phân tích dịch chiết bằng sử dụng cột trao đổi ion biểu diễn bằng Palmer cho thấy vạch rộng hơn vùng axit citric.
Lewis và Neelakantan [21] đã chiết axit chủ yếu trong vỏ quả G. cambogia và xác định nó (-)-HCA là chất chính và được nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ. Sự xác định và tách axit hydroxycitric bằng giấy Whatman No.1 được thực hiện bằng cách sử dụng n-butanol/axit axetic/nước (4:1:5) và n-propanol/axit formic/nước (4:1:5). Các vạch được xác định bằng phun metavanadate 5%. Xà phòng hóa axit bằng cách trộn với lượng kiềm dư
và cho đi qua cột nhựa trao đổi ion (Zeocarb 215), kết quả rửa cho thấy chỉ có vạch (Rf = 0,34) có giá trị thấp tương ứng với (-)-HCA tự do. Trong nồng độ
nước rửa cũng còn có vạch cao hơn (Rf = 0,46) đó chính là lacton. Nước chiết từ quả cho thấy có 2 vạch axit nổi trội trong sắc ký với hai hệ dung môi khác nhau. Trong trường hợp chuẩn độ dịch chiết này bằng kiềm, sử dụng phenolphtalein làm chất chỉ thị, thu được 2 điểm tới hạn khác nhau, trong môi trường lạnh và sau đó đun nóng, điều này cho thấy đó là đặc điểm của lacton. Hai vạch sắc ký đã được xem như là axit hydroxy citric và lacton của nó (Hình 1.15 và 1.16). Điều này cũng chứng tỏ rằng 2 vạch trong sắc ký cũng là của axit g-hidroxy và lacton của nó chứ không phải là của axit tactaric và axit citric. COOH C H HO C COOH HO C COOH H H COOH C OH H C OH HOOC C COOH H H
Axit (-)-hydroxycitric (I) Axit (+)-hydroxycitric (II)
COOH C H HO C OH HOOC C COOH H H COOH C OH H C COOH HO C COOH H H
Axit (+)-allo-hydroxycitric (III) Axit (-)-allo-hydroxycitric (IV)
O OH COOH COOH H H O H O COOH OH COOH H H O H
(-)-HCA lacton (+)-HCA lacton (+)-allo-HCA lacton (-)-allo-HCA lacton (2S,3S)-HCA lacton (2R,3R)-HCA lacton (2S,3R)-HCA lacton (2R,3S)-HCA lacton
O COOH OH H H H O HOOC O OH COOH H H H O HOOC
Hình 1.16. Cấu trúc đồng phân lacton của axit hydroxycitric
Lewis và Neekantan [21] đã chiết tách một tỉ lệ lớn (-)-HCA từ vỏ quả
G. cambogia khô. Phương pháp gồm có chiết tách axit bằng cách nấu vật liệu thô với nước dưới áp suất (10psi (lb/in2 trong thời gian 15 phút). Dịch chiết
được cô đặc và pectin được loại bỏ bằng cách kết tủa với rượu. Dịch lọc sạch
được trung hòa bằng kiềm, cho qua cột nhựa trao đổi cation để khỏi khôi phục lại axit, sau đó dịch này được cô đặc và sấy. Khối lượng khô sau sấy được chiết với ete và kết tinh lại để thu được lượng nhỏ tinh thể hình kim của lacton. Lewis [22] đã báo cáo một phương pháp nữa dùng để chiết tách (-)- HCA từ G. cambogia bằng cách sử dụng axeton. Dịch chiết bằng axeton được cô đặc và axit được hòa tan trong nước. Sau khi cho bay hơi nước dung dịch hòa tan thu được sản phẩm lacton. Moffett và những cộng sựđã phát triển quá trình chiết tách (-)-HCA bằng nước từ vỏ Garcinia. Dịch chiết được cho qua cột trao đổi anion để hấp phụ (-)-HCA, và nó được rửa với natri/kali hidroxit
để thu (-)-HCA. Dịch chiết được cho qua cột trao đổi cation để thu sản phẩm axit tự do. Guthrie và Kierstead, Moffett và những cộng sự đã báo cáo dịch cô
đặc từ vỏGarcinia chứa 23-54% (-)-HCA và 6-20% lacton.
Martius và Maue [25] đã tổng hợp thành công 04 đồng phân lập thể của hydroxycitrate. Một trong các đồng phân này được tìm thấy trong Garcinia
(Hình 1.15, I) và một đồng phân nữa được tìm thấy trong loài cây dâm bụt (Hibiscus) (Hình 1.15, II). Cấu hình chính xác lactone của axit hydroxycitric, axit hibiscus và axit garcinia, đã được xác định lần lượt là axit (2S, 3R)- và
(2S, 3S)-2-hydroxycitric-2,5-lactone (Hình 1.16). Cấu hình chính xác được xác định bằng quy luật Hudson’s lactone, chiều quay quang học của ánh sáng phân cực, vòng tròn của ánh sáng lưỡng sắc và tính toán góc quay của phân tử
[11]. Glusker và những cộng sự [12] đã báo cáo cấu trúc và cấu hình chính xác của canxi hydroxycitrate và (-)-HCA lactone bằng chụp nhiễu xạ tia X. Stallings và những cộng sự báo cáo cấu trúc tinh thể muối etylen diamin cặp
đồng phân lập thể hydroxycitrate.
Hiroyuki Hida và các cộng sự [16] đã xác định sự khác biệt của (2S, 3S)-HCA, lactone của nó và (2S, 3R)-HCA, lactone của nó dựa vào phổ 1H- NMR của đồng phân (2S, 3S)-HCA methyl este, lactone của nó (Hình 1.10) từ G. cambogia và (2S, 3R)-HCA methyl este, lactone của nó (Hình 1.10) từ
Hibiscus subdariffa. COOH C H f H O H O C C H e C O O C H3 1 3 COOH C C C C O O C H3 OH H d C O O C H3 H d H e H3C O O C H O H f O O H COOCH 3 COOH Ha Hb O He O COOCH 3 O H COOH Ha Hb O He 2 4
Hình 1.17. Cấu trúc của HCA methyl esters và lactone của nó được chuẩn bị từ G. cambogia (1 và 2) và Hibiscus subdariffa (3 và 4)
Phổ 1H-NMR (trong D2O, 300 MHz) của (2S, 3S)-HCA từ G. cambogia ở dạng lactone: 2,79 ppm (Ha, d, J = 18 Hz), 3,14 ppm (Hb, d, J = 18 Hz), 5,3 ppm (Hc, s); dạng acid tự do: 2,91 ppm (He, d, J = 16,5 Hz), 3,01
ppm (Hd, d, J = 16,5 Hz), 4,9 ppm (Hf, s). Còn đối với (2S, 3R)-HCA từ
Hibiscus subdariffa ở dạng lactone: 2,70 ppm (Hb, d, J = 17,7 Hz), 3,24 ppm (Ha, d, J = 17,7 Hz), 5,11 ppm (Hc, s); dạng acid tự do: 2,84ppm và 2,79 ppm (He, Hd, d, J = 16,2 Hz), 4,37 ppm (Hf, s). H của các nhóm –OH không thể
hiện trên phổ1H-NMR của (2S, 3R)-HCA và (2S, 3S)-HCA.
Lowenstein và Brunengraber [24] đã xác định lượng hydroxycitrate chứa trong quả G. cambogia bằng phương pháp sắc ký khí (GC). Các tác giả
này sử dụng cột sắc ký khí OV-17 (3m x 3mm i.d.). Cột này được chạy ở
nhiệt độ 145oC, sử dụng nitơ làm khí mang (40ml/phút) với nhiệt độ tiêm vào là 250oC và đầu dò nhiệt độ là 300oC. (-)-HCA lactone là thành phần chính có trong dịch chiết, và sau khi kết tinh có chứa < 0,5% tạp chất. Qua cột sắc ký khí cần phải sấy khô hoàn toàn mẫu, nhưng (-)-HCA có khuynh hướng bị
lactone hoá trong quá trình sấy, ngoài ra (-)-HCA hút ẩm cao trong tự nhiên nên cũng gây khó khăn trong việc sấy mẫu. Từ các lý do này, không thể đánh giá định lượng được (-)-HCA tự do bằng sắc ký khí.
Gần đây, Jayaprakasha và Sakariah [19] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định axit hữu cơ trong quả của G. cambogia, mẫu chiết thương mại của G. cambogia, và lá, vỏ quả của G. indica. Trong phương pháp HPLC này, dịch chiết pha loãng có thể xác định định lượng mà không cần cô đặc, sấy. Đây là điểm thuận lợi để có thểđịnh lượng (-)-HCA và lactone của nó một cách riêng biệt.
Tính chất của (-)-HCA và lacton: Tính chất vật lý của (-)-HCA và lacton từ Garcinia và Hibiscus giới thiệu tại Bảng 1.1. Đương lượng của lacton sạch là 69, xác định bằng chuẩn độ kiềm hoặc phân tích bằng muối bạc. Phổ IR của etyl este và nhóm hydroxyl lần lượt là 5,41-5,76 và 2,74-2,79
μ. Cấu trúc của (-)-HCA lacton đã được chứng minh bằng phổ IR và 1H NMR. (-)-HCA lacton thể hiện rõ dải sóng phổ IR tại 3200, 1760 và 1680 cm- 1. Quang phổ 1H NMR của (-)-HCA lacton cho thấy 2 proton tại γ-cacbon, nó
cho AB quartet tại δ 2.53 và δ 2.74 với J=17.1 Hz và 01 proton tai α-cacbon cho thấy một singlet tại δ 5.15.
Bảng 1.1. So sánh tính chất vật lý của HCA, lacton từ Garcinia và Hibiscus
Tính chất Garcinia Hibiscus
Mp (0C) 178 183
[α]20D (độ) -20 100 122 31
Hình dạng tinh thể Hình kim Hình kim
Hút ẩm Yếu Tốt
Tính tan Tan tốt trong
rượu và nước; trung bình trong ete Tan tốt trong nước và rượu; tan yếu trong ete Sắc ký giấy (Rf) Butanol/axitformic/H2O 0,24 0,42 0,15 0,39 Propanol/axit axetic/H2O 0,26 0,36 0,35 0,26 Metavandate spray (5%) Màu vàng Màu da cam hơn đỏ Màu vàng Màu vàng
b. Tính chất của (-)-HCA
Bảng 1.2. Các đặc trưng cơ bản và tính chất của HCA
Nguồn thực vật Garcinia cambogia
Họ thực vật Họ bứa (họ măng cụt), Guttiferae
Các tên gọi khác nhau
Axit (-)-hydroxycitric; axit 1,2-dihydroxy-1,2,3- propan tricacboxylic; axit Garcinia; axit 1,2-
dihydroxy propan-1,2,3-tricacboxylic
CAS No. 27750-10-3 [(-)-HCA]
Công thức phân tử C6H8O8 [(-)-HCA]
Khối lượng phân tử 208 [(-)-HCA]
Trạng thái vật lý Bột, không xơ sợi
Màu Trắng kem
Mùi Không mùi
Vị Vị chua axit
Lưu giữ Trong chai lọ chịu được hơi ẩm, không khí, ánh sáng
c. Những nghiên cứu về các muối kim loại của (-)-HCA
Ibnusaud và những cộng sự [18] đã báo cáo cách chiết tách axit
Garcinia từ vỏ quả tươi hoặc khô của G. cambogia, G. indica, và G. atroviridis. Nó bao gồm 4 đến 5 cách chiết quả Garcinia bằng cách nấu với nước trong vòng 20 giờ. Hỗn hợp dịch chiết được cô đặc, xử lý bằng metanol
để loại bỏ pectin. Phần nước lọc được xử lý bằng dung dịch xút (NaOH) ở
800C nhằm thu được natri hydroxycitrate [20].
C H H O H O C C H C O O N a C O O N a C O O N a H C H H O H O C C H C O O K C O O K C O O K H C H H O H O C C H C O O C O O C O O H O O C C a C a
C anxi h y dro xy citrate N atri h y d ro xy citrate K ali h yd ro xycitrate C H H O H O C C H C O O C O O H C a Hình 1.18. Cấu trúc các dẫn xuất của axit hydroxycitric
Singh và các cộng sự mô tả việc tổng hợp muối canxi của (-)-HCA. Mặt hạn chế của muối này là không tan nhiều trong nước. Ganga Raju mô tả
việc tổng hợp muối canxi và kali của (-)-HCA hay muối hai kim loại natri của (-)-HCA và hiệu quả của nó như là những chất bổ sung ăn kiêng và những sản phẩm thức ăn để giảm cân nặng [20].
Majeed và các cộng sự chỉ ra một cách thức mới để tạo ra HCA dưới dạng bền vững và có hoạt tính sinh học. Phương pháp này bao gồm quá trình chiết (-)-HCA từ quả Garcinia bằng cách sử dụng rượu alkyl, dịch chiết trộn lẫn được xử lý bằng kali hydroxide và kết tủa kali hydroxycitrate hình thành lắng xuống đáy. Tiến trình này được sử dụng để phân lập (-)-HCA cũng như
HCK từ nguồn cung cấp tự nhiên là những loài Garcinia, bao gồm G. cambogia và G. Indica. Các tác nhân chiết tách là các loại rượu alkyl, đặc biệt chọn lựa CH3OH. Dịch chiết được xử lý với các hợp chất kiềm như KOH, K2CO3... Hỗn hợp thu được đem sấy khô và pH được điều chỉnh làm dung dịch có tính kiềm, thường giữa khoảng 8÷11,5. Sản phẩm sấy khô tại 250C hoặc hơn, dưới áp suất chân không hoặc tại áp suất khí quyển hoặc dưới khí quyển trơ (ví dụ: N2). Sản phẩm sấy khô được xay, sàng, trộn và đóng gói dưới 1 lớp N2 dày để giữ sản phẩm.
Bhaskaran và Mehta [10] đã công bố phương pháp hình thành muối canxi và kali của HCA và hỗn hợp của chúng. Các tác giả cũng mô tả cách sử
dụng những hợp chất muối của (-)-HCA như những phần bổ sung trong khẩu phần ăn kiêng. Phương pháp điều chế hợp chất muối HCA của Bhaskaran và Mehta [9] cung cấp muối tinh khiết, với hàm lượng HCA ít nhất 70 – 75% và lactone hàm lượng không quá 0,5%. Phương pháp bao gồm chiết G. cambogia
hoặc G. indica với tác nhân thích hợp là trialkylamin, đặc biệt là tricaprylamin. Xử lý dịch chiết thu được bằng KOH hoặc NaOH và thu lại dung dịch muối kali hoặc muối natri hydroxycitrate. Dùng than hoạt tính để
muối Ca hydroxycitrate, thì cho dung dịch muối K hoặc Na hydroxycitrate thu được tác dụng với một dung dịch muối Ca (như CaCl2) thu được hỗn hợp kết tủa có chứa muối canxi không tan của HCA. pH được điều chỉnh thích hợp là trong vùng 9,5 – 11 để thu được chất kết tủa canxi hydroxycitrate. Chất kết tủa được làm sạch và sấy khô để thu được một chất bột canxi hydroxycitrate tinh khiết. Chế phẩm muối Ca của HCA tạo thành có hàm lượng HCA khoảng 72%, hàm lượng canxi khoảng 17% và khoảng 10% khối lượng nước.
Shrivastava và các cộng sự đã đưa ra quy trình tạo muối magie của HCA. Balasubramanyam và những cộng sự [8] đưa ra phương pháp tạo thành cặp muối kim loại hòa tan nhóm IA và IIA của (-)-HCA. Phương pháp này bao gồm (-)-HCA chiết bằng nước và xử lý dịch chiết với các loại hydroxide và clorua kim loại khác nhau để được cặp muối kim loại, sau đó làm kết tủa muối tan hai kim loại bằng cách thêm dung môi phân cực để phân lập muối tan hai kim loại nhóm IA và IIA của (-)-HCA. Dung môi phân cực được sử
dụng là dung dịch acetone 80%.
Trong đó, X là kim loại nhóm IA như: Li, Na, K, Rb, Cs hay Fr. Y là kim loại nhóm IIA như: Be, Mg, Ca, Sr, Ba hay Ra.
C H H COO X C OH COO C HO COO H Y
Hình 1.19. Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm IA và IIA
Gokaraju và các cộng sự [13] công bố dạng muối hai kim loại của (-)- HCA với các kim loại nhóm II. Quá trình tổng hợp những muối hai kim loại
nhóm II bao gồm việc thêm một hợp chất kim loại nhóm II vào dung dịch (-)- HCA, tiếp theo thêm một dung dịch hợp chất kim loại nhóm II khác. Muối hai kim loại được thu lại bằng cách loại bỏ nước khỏi hỗn hợp phản ứng dưới áp suất thấp hay sấy khô. Sau đó, muối hai kim loại được chia tách khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách thêm những dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn với nước và lọc. Những dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn với nước là rượu, acetone, acetonitrin, dioxan, tetrahydrofuran hay hỗn hợp của chúng. Công thức của chúng được kiểm tra bằng phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C-NMR.
Những muối hai kim loại của (-)-HCA được thể hiện trong công thức chung như Hình 1.20: HO COO COO HO HO HO COO COO X X COO Y OCO
Hình 1.20. Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm II
Trong đó: X, Y được lựa chọn độc lập từ những kim loại thuộc nhóm II (IIA và IIB) của bảng tuần hoàn. Những kim loại nhóm II và được lựa chọn
độc lập từ Be, Mg, Ca, Ba hay Ra (nhóm IIA), Zn, Cd hay Hg (nhóm IIB) trong các hợp chất cacbonat, oxit hay hydroxyt của chúng.
Gokaraju và các cộng sự [14] cũng công bố công thức của muối ba kim loại của (-)-HCA. Muối ba kim loại phổ biến là muối ba kim loại của canxi, magiê hoặc kẽm và kali. Nghiên cứu này bao gồm quá trình tạo muối ba kim loại bằng việc thêm những lượng xác định các dung dịch hợp chất của các kim loại mong muốn vào dung dịch (-)-HCA. Dịch chiết từ vỏ quả Garcinia
được sử dụng như là nguyên liệu ban đầu. Những hợp chất thu được của nghiên cứu này không vị, không mùi và tan tốt trong nước và cũng có chức năng chữa bệnh béo phì. Chúng có thể được sử dụng trong khẩu phần ăn hằng ngày hay thức uống. Công thức của chúng được kiểm tra bằng phổ cộng hưởng từ1H-NMR và 13C-NMR.
Muối ba kim loại của (-)-HCA có công thức thông thường như Hình 1.21 HO HO COO COO COOZ OOC OOC OH OH COOZ X Y
Hình 1.21. Công thức thông thường muối ba kim loại
Trong đó, X và Y được lựa chọn từ kẽm hay những kim loại nhóm IIA và Z được lựa chọn từ những kim loại nhóm IA.
Samuel và các cộng sự đã nghiên cứu các muối phức tạp ba, bốn và năm kim loại của (-)-HCA, thành phần cấu tạo và những phương pháp tổng hợp chúng, với các muối chứa ít nhất 3 kim loại khác nhau được lựa chọn từ
kẽm, magie, natri, kali và canxi. Trong thành phần của muối có chứa 2 phân tử của HCA. Thành phần (-)-HCA trong các muối trên chiếm 40 – 75% khối