5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.5.2. Vi khuẩn Escherichia coli
Escherichia coli (E.coli) đƣợc tìm thấy bởi bác sĩ nhi khoa Theodor Escherich qua những thí nghiệm lâm sàng về bệnh tiêu chảy năm 1885 . Escherichia coli thuộc phân loại khoa học sau:
Vực: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceas Chi: Escherichia Loài: E.coli a. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, bắt màu gram âm, có kích thƣớc 2-3 µm x 0.3-0.6 µm; ở môi trƣờng nuôi cấy, trong canh khẩn giả, xuất hiện những trực khuẩn dài 4-8 µm. Trong cơ thể ngƣời và động vật, vi khuẩn thƣờng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn vi khuẩn E.coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhƣng khi soi tƣơi thƣờng không nhìn thấy đƣợc. [9]
b. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trƣởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5 - 40oC), nhiệt độ thích hợp nhất là 37o
C và phổ pH rộng từ 5.5 - 8.0.
Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Khi nuôi cấy trên các môi trƣờng, để trong tủ ẩm ở 37o
C và sau 24
giờ vi khuẩn s phát triển:
Môi trƣờng thạch thƣờng: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính từ 2-3 mm, nuôi lâu, lạc khuẩn có màu nâu nhạt và mọc rộng ra.
Môi trƣờng nƣớc thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trƣờng đục, để có lắng cặn màu tro nhạt ở dƣới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
Môi trƣờng MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trƣờng.
Môi trƣờng thạch máu: Khuẩn lạc to, ƣớt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt.
c. Khả năng gây bệnh của E.coli
E.coli là thành viên thuộc nhóm vi khuẩn hệ bình thƣờng của đƣờng tiêu hóa, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Trong điều kiện bình thƣờng, E.coli cƣ trú thƣờng xuyên ở phần sau của ruột, khi có trong dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lƣợng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đƣờng tiêu hóa và nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy. E.coli cũng là 1 vi khuẩn gây một số bệnh nhƣ: viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli là căn nguyên thƣờng gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ em mới sinh. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. [9]
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thu gom nguyên liệu
Mẫu lá và hạt chùm ngây đƣợc thu hái tại xã Tam Đàn, huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam.
Hình 2.1. Lá chùm ngây Hình 2.2. Hạt chùm ngây
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Mẫu lá chùm ngây sau khi thu hái đƣợc xử lí sơ bộ bằng cách loại bỏ lá sâu, hƣ, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm. Sau đó, lá đƣợc sấy trong tủ sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC, xay nhỏ và bảo quản trong bình thủy tinh kín.
Mẫu hạt chùm ngây sau khi thu hái, tách lấy hạt, phơi 3 nắng, sau đó tách vỏ cứng, nhân hạt sấy khô trong tủ sấy ở 50o
C trong nhiều giờ rồi xay nhỏ và bảo quản trong bình thủy tinh kín.
Hình 2.3. Lá chùm ngây phơi khô Hình 2.4. Bột lá chùm ngây
Hình 2.5. Nhân hạt chùm ngây Hình 2.6. Bột hạt chùm ngây
2.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
* Lựa chọn dung môi chiết
Chọn dung môi phải không hoặc ít độc, không quá dễ cháy, hòa tan đƣợc các chất cần khảo sát, phù hợp với phƣơng pháp mà ta tiến hành phân tích (với phƣơng pháp GC-MS ta phải chọn dung môi dễ bay hơi và ít phân cực…), phù hợp với điều kiện kinh tế và phải thông dụng, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, dung môi có thể loại bỏ một cách dễ dàng sau khi chiết tách.
Bảng 2.1. Các dung môi có độ phân cực tăng dần tùy vào hằng số điện môi và độ nhớt
Tên dung môi
Chỉ số phân cực Chỉ số chiết xuất (20oC) Nhiệt độ sôi (oC) Hằng số điện môi ε (ở 25oC) Độ nhớt (mN.S .m-2) Bƣớc sóng hấp thu UV Độ tan trong nƣớc (%W/ W) Pentan 0.0 1.358 36 - 0.23 200 0.004 Hexan 0.0 1.375 69 1.90 0.33 200 0.001 Heptan 0.0 1.387 98 - 0.39 200 0.0003 Cyclohexan 0.2 1.426 81 2.0 1.00 200 0.01 Carbon tetraclorur 1.6 1.466 77 2.2 0.97 263 0.08 Toluene 2.4 1.496 111 2.38 0.59 285 0.51 Xylen 2.5 1.500 139 - 0.61 290 0.018 Benzene 2.7 1.501 80 2.3 0.65 280 0.18 Dietyl eter 2.8 1.353 35 4.34 0.32 220 6.89 Diclorometan 3.1 1.424 41 8.9 0.44 235 1.6 Isopropanol 3.9 1.399 118 - 2.98 215 7.81 Butanol 3.9 1.399 118 - 2.98 215 7.81 Tetrahydrofuran 4.0 1.407 65 7.58 0.55 215 100 Propanol 4.0 1.384 92 20.1 2.27 210 100 Butyl axetat 4.0 1.394 125 - 0.73 254 0.81 Chloroform 4.1 1.446 61 4.87 0.57 254 0.81 Etyl axetat 4.4 1.372 77 6.0 0.45 260 8.7 Metyl etylceton 4.7 1.379 80 - 0.45 329 24 Dioxan 4.8 1.422 101 2.2 1.54 215 100 Aceton 5.1 1.359 56 20.7 0.32 330 100 Metanol 5.1 1.329 65 33.6 0.6 205 100 Etanol 5.2 1.360 78 24.3 1.2 210 100 Acetonitrile 5.8 1.244 82 37.5 0.37 190 100 Axit axetic 6.2 1.372 118 62 1.26 230 100 Dimetylformami 6.4 1.432 155 - 0.92 368 100 Dimetylsulfoxid 7.2 1.478 189 4.7 2.00 268 100 Nƣớc 9.0 1.333 100 78.5 1.0 200 100
Các số liệu trong bảng cho thấy có sự chênh lệch trong thứ tự sắp xếp độ phân cực của dung môi.
* Dung môi sử dụng
Khảo sát thành phần hợp chất hữu cơ trong lá và hạt chùm ngây cần chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau. Trong đề tài, quá trình chiết tách sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực tăng dần gồm:
+ n-hexan: C6H14, M = 86.16 g/mol, chất lỏng không màu, không tan trong nƣớc, có khối lƣợng riêng D = 0.6548 g/ml, = -95oC, = 69oC.
+ Diclometan: CH2Cl2, M = 84.93 g/mol, chất lỏng không màu, độ hòa tan trong nƣớc 1.3 g/ml ở 20oC, khối lƣợng riêng D = 1.3255 g/ml, = - 96.7oC, = 41oC.
+ Etyl axetat: C4H8O2, M = 88.11 g/mol, chất lỏng không màu, độ hòa tan trong nƣớc 8.3 g/ml ở 20oC, khối lƣợng riêng D = 0.8897 g/ml, = - 84oC, = 77oC.
+ Etanol: C2H6O, M = 46.07 g/mol, chất lỏng không màu, tan hoàn toàn trong nƣớc, khối lƣợng riêng D = 0.789 g/ml, = -114.3oC, = 78oC.
Ngoài ra còn một số hóa chất khác. Các hóa chất có nguồn gốc Trung Quốc.
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng II (quatest II), số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng.
- Thiết bị đo sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng II (quatest II), số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng.
- Thiết bị đo sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm hóa dầu, khoa Hóa học, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội.
Hình 2.7. Hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS
- Tủ sấy (hình 2.8), Lò nung (hình 2.9).
Hình 2.8. Tủ sấy Hình 2.9. Lò nung
- Bếp cách thủy (hình 2.10), Máy cô quay chân không (hình 2.11).
- Hai bộ chiết soxhlet. - Cân phân tích.
- Nồi hấp, tủ cấy vô trùng tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh, trƣờng Đại học Sƣ Phạm - Đại học Đà Nẵng.
Ngoài ta còn có các dụng cụ khác: bình tam giác, cốc thủy tinh, chén sứ, đĩa petri, pipet, ống đong, bình hút ẩm, giấy lọc,…
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định các thông số vật lý 2.2.1. Xác định các thông số vật lý
a. Xác định độ ẩm
* Nguyên tắc
Nguyên liệu ẩm có thể xem nhƣ hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nƣớc tự do. Độ ẩm tƣơng đối của nguyên liệu ẩm là tỉ số của khối lƣợng nƣớc trên khối lƣợng chung của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm.
Độ ẩm của nguyên liệu phải nằm trong giới hạn cho phép để đảm bảo nguyên liệu không bị mốc hay hƣ hỏng, thông thƣờng độ ẩm an toàn của nguyên liệu đƣợc quy định không quá 13%. Do đó, có thể xác định độ ẩm bằng cách:
- Sấy trong tủ sấy ở áp suất thƣờng.
- Sấy trong tủ sấy có áp suất giảm (có hút chân không). - Sử dụng bình hút ẩm.
Trong đề tài này dùng tủ sấy để sấy, dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nƣớc trong mẫu. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính đƣợc phần trăm nƣớc có trong mẫu.
* Tiến hành
Lấy 3 chén sứ rửa sạch và ký hiệu sẵn, sấy trong tủ sấy đến khối lƣợng không đổi. Sấy xong cho vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ phòng, rồi đem cân chén sứ, ghi giá trị m1 (gam).
Xác định độ ẩm lá chùm ngây:
+ Lấy vào 3 chén sứ, mỗi chén m (gam) bột lá chùm ngây.
+ Sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100oC. Cứ 3 giờ, lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm đến khi cốc nguội đến nhiệt độ phòng thì tiến hành cân. Và cứ tiếp tục thực hiện thao tác trên cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp có sai số không quá 0.001 gam. Cân cốc chứa mẫu m2 (gam).
* Tính toán
Độ ẩm bột lá chùm ngây đƣợc tính bằng công thức:
Trong đó,
w: Khối lƣợng nƣớc chứa trong nguyên liệu (%) m: Khối lƣợng của nguyên liệu (gam)
m1: Khối lƣợng chén sứ (gam)
m2: Khối lƣợng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (gam) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
Phƣơng pháp này cũng dùng để xác định độ ẩm bột hạt chùm ngây.
b. Xác định hàm lượng tro
Tro là khối lƣợng còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
Để xác định hàm lƣợng hữu cơ tổng và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động thực vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp tro hóa mẫu.
* Nguyên tắc:
- Phá hủy hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ (525 25)oC đến khối lƣợng không đổi.
- Dụng cụ: Cốc sứ, bình hút ẩm, cân phân tích, lò nung.
* Tiến hành:
Đem mẫu đi than hóa trên bếp điện và cho vào tủ nung ở 200oC trong khoảng 2 giờ, tiếp tục nâng nhiệt độ lên 500oC tro hóa mẫu trong thời gian 4 giờ, nung xong lấy mẫu ra khỏi lò, làm nguội trong bình hút ẩm, cân và ghi lại khối lƣợng chén nung và tro.
Tiếp tục cho cốc vào lò nung và thực hiện quá trình trên cho đến khi khối lƣợng liên tiếp giữa hai lần cân chênh nhau không quá 0.001 gam thì dừng, ghi giá trị m3 (gam).
Sau khi tro hóa lá chùm ngây hoàn toàn, lúc này tro ở dạng mịn, có màu xám trắng.
* Tính toán:
Hàm lƣợng tro đƣợc tính bằng công thức:
Trong đó:
m: Là khối lƣợng nguyên liệu (gam). m1: Là khối lƣợng của chén sứ (gam).
m3: Là khối lƣợng của chén sứ và lá chùm ngây sau khi tro hóa (gam). Phƣơng pháp này cũng dùng để xác định hàm lƣợng tro của bột hạt chùm ngây.
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Mẫu bột lá và hạt chùm ngây sau khi tro hóa đƣợc vô cơ hóa về dạng muối vô cơ cho dễ tan. Cho toàn bộ mẫu tro hóa hòa tan trong dung dịch HNO3 đặc và định mức đến 100 ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lƣợng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng II (quatest II), số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng.
Công thức chuyển đổi từ hàm lƣợng mg/l sang hàm lƣợng mg/kg nhƣ sau:
Trong đó: m: khối lƣợng mẫu bột trƣớc khi tro hóa
2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
a. Giới thiệu chung
Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách và tinh chế để tách nó ra khỏi môi trƣờng rắn hoặc lỏng khác. Thƣờng ngƣời ta dùng một dung môi thấp và ít tan trong nƣớc (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thƣờng ít tan trong nƣớc), chất cần tách s chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phễu để tách riêng dung dịch thu đƣợc ra khỏi nƣớc.
Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó chƣng cất loại bỏ dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp.
Ngƣời ta cũng thƣờng chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết soxhlet. Dung môi đƣợc đun nóng, cho bay hơi liên tục và chảy vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách (thƣờng gói bằng giấy lọc), nó s hòa tan chất rắn cần chiết và nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dƣới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục đƣợc cất lên. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc dung môi và hiệu quả tƣơng đối cao.
b. Kỹ thuật chiết soxhlet
* Dụng cụ
Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột dƣợc liệu, gồm ba ống: Ống D có đƣờng kính lớn, ở giữa để chứa bột dƣợc liệu; ống B có đƣờng kính trung bình để dẫn dung môi từ bình cầu A bay lên đi vào ống D chứa bột dƣợc liệu; ống E có đƣờng kính nhỏ, là ống thông nhau để dẫn dung môi từ ống D trả lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngƣng hơi.
Hình 2.12. Bộ chiết soxhlet
* Cách tiến hành
Bột nguyên liệu khô đựng trong một cái túi bằng giấy lọc đƣợc đặt trực tiếp trong ống D. Lƣu ý, đặt vài viên bi thủy tinh dƣới đáy ống D để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở nút mài số 2, lƣợng dung môi phải đủ thấm ƣớt bột nguyên liệu rồi mới chảy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E. Lƣu ý, ở những vị trí gắn kết giữa ống D với bình cầu và ống D với ống C cần bôi vaseline để sau khi hoàn tất có thể tháo dụng cụ dễ dàng.
Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nƣớc chảy hoàn lƣu trong ống ngƣng hơi. Cắm bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi đƣợc đun nóng s bốc hơi lên cao theo ống B, nhờ hệ thống ngƣng tụ, dung môi đƣợc ngƣng tụ tại ống D chứa nguyên
liệu. Dung môi ngấm vào bột nguyên liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lƣợng dung môi rơi vào ống D và đồng thời cũng dâng lên trong ống E. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi s bị hút vào bình A, lực hút này s rút lƣợng dung môi đang chứa trong ống D.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo nhƣ mô tả lúc đầu. Các hợp chất đƣợc rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết.
Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi và thu đƣợc cao chiết.
* Một số lƣu ý khi dùng kỹ thuật chiết soxhlet: