7. Bố cục của khóa luận gồ m3 phần
1.4.4. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
a. Phương pháp sắc ký khí
o Lý thuyết chung
- Sắc ký khí là một trong những phƣơng pháp quan trọng nhất hiện nay dung để tách, định lƣợng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các chất hữu cơ.
o Nguyên lý
- Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử
thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
- Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc rắn đƣợc chuyển thành thể bay hơi nhờ một luồng khí trơ làm chất tải, dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì gọi là sắc ký khí – rắn. Chất rắn đƣợc dùng là những chất có tính hấp phụ nhƣ silicagel, than hoạt tính, oxy nhôm, rây phân tử.
- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí – lỏng. Chất lỏng đƣợc phân tán mỏng nhƣ một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền. Khi chất thử đƣợc khí tải dẫn đi ngang qua lớp chất lỏng, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử với những điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng trong sắc ký khí rất rộng, có thể đến 4000C, nhờ vậy làm tăng ƣu thế của phƣơng pháp sắc ký khí trong việc tách các thành phần ra khỏi hỗn hợp của chúng.
o Dụng cụ
N2) đƣa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ đƣợc hấp phụ lên
trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lƣợt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài đƣợc ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận đƣợc máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Các chất đƣợc xác định nhờ giá trị thời gian lƣu trên sắc ký đồ.
Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau:
- Nguồn cung cấp khí mang:
Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nƣớc cất,…).
- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích - Bộ phận tiêm mẫu:
Bộ phận tiêm mẫu dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi. Khi đƣa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless).
Có 2 cách đƣa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace).
- Cột phân tích: Có 2 loại cột là cột nhồi và cột mao quản.
+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh đƣợc nhồi vào trong cột, cột có đƣờng kính 2-4mm và chiều dài 2-3m.
+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh đƣợc phủ mặt trong (bề dày 0.2- 0.5µm), cột có đƣờng kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m.
- Đầu dò:
Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lƣợng các chất cần phân tích. Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích nhƣ đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID-Flame Ioniation Detetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD- Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame
Photometric Detector), đầu dò NPD (NPD-Nitrogen Phospho Detector), đầu
dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry).
- Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
- In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Hình 2.3 mô tả cấu tạo hệ thống sắc ký khí
Hình 1.5. Cấu tạo hệ thống sắc ký khí
Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp sắc ký khí - Ƣu điểm
+ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất.
+ Không cần làm bay hơi mẫu.
+ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột. + Độ nhạy cao nhờ đầu dò.
- Nhƣợc điểm
+ Phƣơng pháp này ít chọn lọc do không loại trừ đƣợc hết đƣợc ảnh hƣởng của nền mẫu.
b. Phương pháp khối phổ (MS)
o Lý thuyết chung
- Đặc điểm
+ Phƣơng pháp khối phổ là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng phân tử chất đó. Chất nghiên cứu trƣớc tiên đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ kế. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà ngƣời ta phân biệt máy khối phổ ion dƣơng hay âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dƣơng cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
+ Ngƣời ta có thể dùng phƣơng pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Đối với hợp chất vô cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
+ Đối với hợp chất hữu cơ, phƣơng pháp phân tích khối phổ thƣờng đƣợc dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.
- Nguyên lý
+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng.
+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng ứng với lƣợng khối của mỗi ion.
nhau.
+ Máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách đƣợc hai mảnh ion có khối lƣợng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e).
+ Loại máy có độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao. Loại máy có mức phân giải thấp nhất cũng có thể tách đƣợc các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion có số khối dƣới 500m/e.
- Dụng cụ
Gồm 5 bộ phận chính:
+ Bộ phận nhận và xử lý chất thử. + Buồng ion hóa.
+ Bộ phận phân tích từ.
+ Bộ phận tập hợp ion và phóng đại. + Bộ phận ghi.
- Ứng dụng
+ Xác định các hợp chất chƣa biết bằng cách dựa vào khối lƣợng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó.
+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất. + Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nó.
c. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phƣơng pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị GC – MS đƣợc cấu tạo thành hai phần: Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết
hợp hai kĩ thuật này, các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và
định lƣợng, có cách giải quyết đối với một số hóa chất.
Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng kĩ thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành nhƣ y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,...
o Nguyên tắc hoạt động
-Tƣơng tự nhƣ các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu và bộ phận in dữ liệu phân tích. Trong đó đầu dò là đầu dò khối phổ.
-Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau, sau đó các io đƣợc ghi nhận bởi đầu dò.
o Ƣu điểm
-Chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ.
-Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn phức tạp.
-Kết quả thu nhận đƣợc một cách nhanh chóng (từ 1 đến 100 phút). -Độ chính xác cao.
-Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp. -Trang thiết bị không quá phức tạp.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 2.1.1. Nguyên liệu
a.Thu gom nguyên liệu
- Thân và rễ của Cây nở ngày đất đƣợc thu hái tại Quế Sơn- Quảng Nam.
- Tên khoa học: Gomphrena celosioides.
b.Xử lý nguyên liệu
Thân và rễ cây của cây Nở ngày đƣợc thu hái về loại bỏ các lá úa, héo. Đối với rễ cây, loại bỏ tạp chất. Rửa thật sạch bằng nƣớc, để ráo, xắt lát rồi phơi khô, nghiền thành bột mịn thể hiện ở Hình 2.1, 2.2, 2.3 và 2.4
Hình 2.1. Thân cây nở ngày đất Hình 2.2. Bột nguyên liệu (thân)
2.1.2. Hóa chất - n-hexane - Ethyl acetate - Dichloromethane - Methanol - Cloroform - Acid acetic - Nƣớc cất
- Các loại thuốc thử (TT): TT Mayer, TT Dragendroff, TT Bourchat.
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
- Bộ chiết Soxhlet 250ml - Ống nghiệm - Bình tam giác - Chén nung
- Bếp cách thủy - Bình hút ẩm - Bếp điện - Giấy lọc
- Cân phân tích - Muỗng - Ống nghiệm - Phễu lọc - Cốc thủy tinh - Tủ sấy - Ống nghiệm - Lò nung - Máy cô quay chân không
2.2. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
2.2.2. Cách xác định các chỉ tiêu hóa lý
a. Độ ẩm
Bột cây nở ngày đất đƣợc xác định độ ẩm dựa theo phụ lục 9.6 (DĐVN IV).
oCách tiến hành như sau:
- Dùng cốc, có nắp làm dụng cụ đựng mẫu thử; làm khô cốc trong tủ sấy thời gian 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân để xác định khối lƣợng cốc, ta có m0.
- Mẫu thử là mẫu bột cây nở ngày đất, đƣợc trộn đều và lấy ngẫu nhiên. Cân
chính xác vào cốc đã đƣợc chuẩn bị ở trên một lƣợng bột dƣợc liệu
khoảng 5g, ta có m1.
- Tiến hành sấy ở 105oC (nhiệt độ thực cho phép chênh lệch ±2o C so với nhiệt độ quy định) trong tủ sấy ở áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi, tức là sự chênh lệch khối lƣợng sau khi sấy thêm một giờ trong tủ sấy so với lần sấy trƣớc đó không quá 0.5mg.
- Sau khi sấy phải làm nguội đến nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay, ta có m2.
- Tiến hành đo 5 mẫu trong 5 khoảng thời gian, kết quả trung bình chính là độ ẩm nguyên liệu.
oCông thức tính độ ẩm như sau:
% W = ( ) *100% 1 2 0 1 m m m m % W tb = 1 %w n n Trong đó: m0:Khối lƣợng cốc (gr) m1: Khối lƣợng bột dƣợc liệu (gr)
m2:Khốilƣợng cốc + bột dƣợc liệu sau khi sấy (gr) n: Số lần xác định độ ẩm
W: Độ ẩm (%)
b. Hàm lượng tro
Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động, thức vật ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp tro hóa mẫu. Tro chính là khối lƣợng chất vô
cơ khó bay hơi còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn bột dƣợc liệu.
(DĐVN IV)
o Cách tiến hành
- Chuẩn bị 5 chén sứ, rửa sạch, tráng lại bằng nƣớc cất, sấy khô, sau đó đem cân, ta có m1.
- Dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 5g bột dƣợc liệu cho vào chén sứ đã chuẩn bị ở trên, ta có m2.
- Sau khi đã chuẩn bị đủ 5 mẫu, ta tiến hành than hóa trên bếp điện trƣớc (bột dƣợc liệu chuyển thành than đen thì ngừng), sau đó mới tro hóa trong tủ nung.Mẫu đƣợc nung ở nhiệt độ 500oC, trong khoảng thời gian 6 giờ. Trong quá trình nung, nếu thấy còn một ít than đen chƣa hóa thành tro thì ta để nguội mẫu rồi tia thêm một ít acid đặc để quá trình tro hóa diễn ra nhanh hơn. Quá trình tro hóa kết thúc khi ta thu đƣợc tro có màu trắng.
- Sau khi nung xong ta đem mẫu bỏ vào bình hút ẩm có silicagel khoảng 30 phút rồi đem ra cân, ta có m3.
o Công thức tính hàm lượng tro như sau:
% 100 % 2 1 3 m m m tro % tro trung bình = n tro n 1 % Trong đó: m1: khối lƣợng chén sứ (gr) m2: khối lƣợng bột dƣợc liệu (gr)
m3: khối lƣợng chén sứ và bột dƣợc liệu sau khi tro hóa (gr) n: số lần xác định hàm lƣợng tro
2.2.3. Xác định hàm lƣợng kim loại nặng bằng phƣơng pháp đo quang phổ (AAS) quang phổ (AAS)
kim loại nặng.
o Cách tiến hành
- Mẫu dƣợc liệu sau khi nung để nguội trong trong bình hút ẩm silicagel khoảng 30 phút, đem cân.
- Dùng acid H2SO4 đặc hòa tan mẫu.
- Tiếp tục dùng nƣớc cất vào định mức đến 100 ml, lọc mẫu đã đƣợc hòa tan đến khi dung dịch trong không còn đục.
Cho dung dịch trong đã đƣợc lọc vào ống đựng có nút đậy, gửi mẫu đi đo hàm lƣợng kim loại nặng có trong mẫu tại trƣờng Đại học Bách Khoa Đà Nẵng phòng Sinh Môi Trƣờng.
2.2.4. Phƣơng pháp tách chất từ cây nở ngày đất bằng dung môi n- hexane và ethylacetate bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet n- hexane và ethylacetate bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet
a. Nguyên tắc
Phƣơng pháp chiết Soxhlet là phƣơng pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Dung môi bay hơi ngƣng tụ hòa tan các cấu tử trong mẫu tạo các dịch chiết. Đặc biệt dụng cụ chiết Soxhlet có thêm một ống xi – phông gắn bên cạnh để dịch chiết chảy vào bình cầu khi nào mức chất lỏng trong ống chiết tăng lên tới khuỷu trên của ống xi – phông. Các chất đƣợc chiết cần có tỷ khối lớn hơn dung môi. Trong quá trình đó cấu tử cần đƣợc tách đƣợc làm giàu thêm trong dung môi.
b. Quy trình chiết tách
Cân chính xác lƣợng mẫu cần chiết Soxhlet gói vào giấy lọc, đƣa vào thiết bị chiết. Lắp bộ chiết Soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lƣu. Dung môi đựng trong bình cầu, bốc hơi từng phần, dung môi đƣợc ngƣng tụ nhỏ vào chất đƣợc chiết đựng trong một cái túi giấy lọc và sau đó chảy ngƣợc lại vào bình cầu. Dịch chiết thu đƣợc đem cô đến thể tích
xác định và đem cân.
c. Khảo sát thời gian chiết tối ưu đối với cây nở ngày đất.
o Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bộ chiết Soxhlet 250ml, rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sấy khô.
- Cân chính xác khoảng 10g bột thân và rễ cây Nở ngày đất, ta có m1 gói bằng giấy lọc, rồi cho vào thiết bị chiết của bộ chiết soxlhlet. Đong chính xác 150ml dung môi chiết cho vào bình cầu. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của các dung môi trong các khoảng thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12giờ.
- Tiến hành đo khối lƣợng riêng của dung môi chiết bằng cách hút chính xác 10ml dung môi chiết, cho vào cốc đã biết chính xác khối lƣợng