7. Bố cục của khóa luận gồ m3 phần
2.2. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
2.2.2. Cách xác định các chỉ tiêu hóa lý
a. Độ ẩm
Bột cây nở ngày đất đƣợc xác định độ ẩm dựa theo phụ lục 9.6 (DĐVN IV).
oCách tiến hành như sau:
- Dùng cốc, có nắp làm dụng cụ đựng mẫu thử; làm khô cốc trong tủ sấy thời gian 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân để xác định khối lƣợng cốc, ta có m0.
- Mẫu thử là mẫu bột cây nở ngày đất, đƣợc trộn đều và lấy ngẫu nhiên. Cân
chính xác vào cốc đã đƣợc chuẩn bị ở trên một lƣợng bột dƣợc liệu
khoảng 5g, ta có m1.
- Tiến hành sấy ở 105oC (nhiệt độ thực cho phép chênh lệch ±2o C so với nhiệt độ quy định) trong tủ sấy ở áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi, tức là sự chênh lệch khối lƣợng sau khi sấy thêm một giờ trong tủ sấy so với lần sấy trƣớc đó không quá 0.5mg.
- Sau khi sấy phải làm nguội đến nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay, ta có m2.
- Tiến hành đo 5 mẫu trong 5 khoảng thời gian, kết quả trung bình chính là độ ẩm nguyên liệu.
oCông thức tính độ ẩm như sau:
% W = ( ) *100% 1 2 0 1 m m m m % W tb = 1 %w n n Trong đó: m0:Khối lƣợng cốc (gr) m1: Khối lƣợng bột dƣợc liệu (gr)
m2:Khốilƣợng cốc + bột dƣợc liệu sau khi sấy (gr) n: Số lần xác định độ ẩm
W: Độ ẩm (%)
b. Hàm lượng tro
Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động, thức vật ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp tro hóa mẫu. Tro chính là khối lƣợng chất vô
cơ khó bay hơi còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn bột dƣợc liệu.
(DĐVN IV)
o Cách tiến hành
- Chuẩn bị 5 chén sứ, rửa sạch, tráng lại bằng nƣớc cất, sấy khô, sau đó đem cân, ta có m1.
- Dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 5g bột dƣợc liệu cho vào chén sứ đã chuẩn bị ở trên, ta có m2.
- Sau khi đã chuẩn bị đủ 5 mẫu, ta tiến hành than hóa trên bếp điện trƣớc (bột dƣợc liệu chuyển thành than đen thì ngừng), sau đó mới tro hóa trong tủ nung.Mẫu đƣợc nung ở nhiệt độ 500oC, trong khoảng thời gian 6 giờ. Trong quá trình nung, nếu thấy còn một ít than đen chƣa hóa thành tro thì ta để nguội mẫu rồi tia thêm một ít acid đặc để quá trình tro hóa diễn ra nhanh hơn. Quá trình tro hóa kết thúc khi ta thu đƣợc tro có màu trắng.
- Sau khi nung xong ta đem mẫu bỏ vào bình hút ẩm có silicagel khoảng 30 phút rồi đem ra cân, ta có m3.
o Công thức tính hàm lượng tro như sau:
% 100 % 2 1 3 m m m tro % tro trung bình = n tro n 1 % Trong đó: m1: khối lƣợng chén sứ (gr) m2: khối lƣợng bột dƣợc liệu (gr)
m3: khối lƣợng chén sứ và bột dƣợc liệu sau khi tro hóa (gr) n: số lần xác định hàm lƣợng tro
2.2.3. Xác định hàm lƣợng kim loại nặng bằng phƣơng pháp đo quang phổ (AAS) quang phổ (AAS)
kim loại nặng.
o Cách tiến hành
- Mẫu dƣợc liệu sau khi nung để nguội trong trong bình hút ẩm silicagel khoảng 30 phút, đem cân.
- Dùng acid H2SO4 đặc hòa tan mẫu.
- Tiếp tục dùng nƣớc cất vào định mức đến 100 ml, lọc mẫu đã đƣợc hòa tan đến khi dung dịch trong không còn đục.
Cho dung dịch trong đã đƣợc lọc vào ống đựng có nút đậy, gửi mẫu đi đo hàm lƣợng kim loại nặng có trong mẫu tại trƣờng Đại học Bách Khoa Đà Nẵng phòng Sinh Môi Trƣờng.
2.2.4. Phƣơng pháp tách chất từ cây nở ngày đất bằng dung môi n- hexane và ethylacetate bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet n- hexane và ethylacetate bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet
a. Nguyên tắc
Phƣơng pháp chiết Soxhlet là phƣơng pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Dung môi bay hơi ngƣng tụ hòa tan các cấu tử trong mẫu tạo các dịch chiết. Đặc biệt dụng cụ chiết Soxhlet có thêm một ống xi – phông gắn bên cạnh để dịch chiết chảy vào bình cầu khi nào mức chất lỏng trong ống chiết tăng lên tới khuỷu trên của ống xi – phông. Các chất đƣợc chiết cần có tỷ khối lớn hơn dung môi. Trong quá trình đó cấu tử cần đƣợc tách đƣợc làm giàu thêm trong dung môi.
b. Quy trình chiết tách
Cân chính xác lƣợng mẫu cần chiết Soxhlet gói vào giấy lọc, đƣa vào thiết bị chiết. Lắp bộ chiết Soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lƣu. Dung môi đựng trong bình cầu, bốc hơi từng phần, dung môi đƣợc ngƣng tụ nhỏ vào chất đƣợc chiết đựng trong một cái túi giấy lọc và sau đó chảy ngƣợc lại vào bình cầu. Dịch chiết thu đƣợc đem cô đến thể tích
xác định và đem cân.
c. Khảo sát thời gian chiết tối ưu đối với cây nở ngày đất.
o Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bộ chiết Soxhlet 250ml, rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sấy khô.
- Cân chính xác khoảng 10g bột thân và rễ cây Nở ngày đất, ta có m1 gói bằng giấy lọc, rồi cho vào thiết bị chiết của bộ chiết soxlhlet. Đong chính xác 150ml dung môi chiết cho vào bình cầu. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của các dung môi trong các khoảng thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12giờ.
- Tiến hành đo khối lƣợng riêng của dung môi chiết bằng cách hút chính xác 10ml dung môi chiết, cho vào cốc đã biết chính xác khối lƣợng (m2). Cân cốc và dung môi, ta có m3. Tính toán khối lƣợng riêng của dung môi thực hiện.
- Đối với mỗi mẫu sau khi chiết xong, tiến hành đo chính xác thể tích (V) dịch chiết thu đƣợc. Dùng pipet bầu hút chính xác 10ml dịch chiết cho vào cốc đã biết chính xác khối lƣợng (m4). Cân cốc và dịch chiết, ta có khối lƣợng m5. Tính toán suy ra đƣợc khối lƣợng riêng (d) của dịch chiết, từ đó tính đƣợc phần trăm khối lƣợng chiết ra (%m).
oCông thức tính phần trăm khối lượng chiết ra:
D = (g/ml)
d = (g/ml)
%m = (%)
Trong đó:
m1 là khối lƣợng bột thân (rễ)
m3 là khối lƣợng của 10ml dung môi và cốc;
m4 là khối lƣợng cốc dùng đo khối lƣợng riêng dịch chiết; m5 là khối lƣợng của 10ml dịch chiết và cốc.
V là thể tích dịch chiết thu đƣợc; d là khối lƣợng riêng của dịch chiết; D là khối lƣợng riêng của dung môi.
- Với phần trăm khối lƣợng chiết ra của mỗi dung môi theo thời gian chiết, ta suy ra đƣợc thời gian chiết tốt nhất.
- Với các dung môi ethylacetate, dichloromethane, methanol ta tiến hành tƣơng tự nhƣ dung môi n-hexane và cách tiến hành cho thân và rễ cây ta cũng tiến hành nhƣ nhau.
o Khối lượng cặn thu được được tính như sau:
m cặn = m2 – m1
Dịch chiết của thân cây Nở ngày đất thu đƣợc bằng dung môi n- hexane; ethylacetate; dichloromethane; methanol đƣợc thể hiện ở Hình 2.6, 2.7, 2.8 và 2.9.
Hình 2.8. Dịch chiết Dichloromethane Hình 2.9. Dịch chiết Methanol
2.2.5. Định tính các nhóm hợp chất chính trong dịch chiết thân và rễ cây nở ngày đất rễ cây nở ngày đất
Để định tính các nhóm hợp chất chính có trong dịch chiết ta dựa vào các phản ứng đặc trƣng (phản ứng tạo kết tủa, phản ứng tạo màu...).
Cách thử như sau:
Cân 10g bột cây nở ngày đất. Tiến hành chiết Soxhlet mẫu dƣợc liệu ở điều kiện tối ƣu. Lấy dịch chiết và thực hiện các phản ứng sau:
a. Nhóm Saponin
Phản ứng tạo bọt: Lấy hai ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5 ml dung dịch HCl 0,1N và ống thứ hai 5 ml NaOH 0,1N. Cho thêm vào mỗi ống 2 – 3 giọt dịch chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 15 giây. Để yên, thấy ống kiềm có cột bọt bền và cao gấp đôi ống kia.
Nếu có hiện tƣợng nhƣ trên thì kết luận trong dịch chiết có nhóm steroid saponin.
b. Nhóm Alkaloid
Cô 10 ml dịch chiết tới bay hết dung môi. Thêm 10 ml dung dịch CH3COOH 5%, khuấy kĩ rồi lọc lấy dịch chiết axit để làm các phản ứng định tính. Cho dịch chiết acid vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml rồi thêm vào từng ống một loại thuốc thử và kết quả nhƣ sau:
Ống thứ nhất: 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer: có kết tủa trắng.
Ống thứ hai: 2 – 3 giọt thuốc thử Dragenfroff: có kết tủa cam. Ống thứ ba: 2 – 3 giọt thuốc thử Bourchardt: có kết tủa nâu.
Nếu có các hiện tƣợng nhƣ trên thì kết luận trong dịch chiết có nhóm Alkaloid.
c. Nhóm Coumarin
Phản ứng đóng mở vòng lacton: Cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả hai ống nghiệm trên bếp cách thủy trong vài phút. Ống thứ nhất có màu vàng. Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nƣớc cất, thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ hai. Nhƣng sau khi acid hóa thì cả hai ống đều đục nhƣ nhau.
Nếu có hiện tƣợng nhƣ trên thì kết luận trong dịch chiết có nhóm Coumarin.
d. Nhóm Flavonoid
Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm vào một ít bột Mg kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên bếp cách thủy, sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ.
Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ.
Nếu có các hiện tƣợng trên thì kết luận trong dịch chiết có nhóm Flavonoid
e. Đường khử
Lấy khoảng 3ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, đuổi dung môi trên bếp cách thủy thu đƣợc cặn. Hòa cặn với 3 ml nƣớc cất đun nóng, lọc. Cho thêm vào nƣớc lọc 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy. Nếu có kết tủa đỏ gạch thì có nhóm đƣờng khử.
f. Poliphenol
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm 2 – 3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh thẫm.
Nếu có hiện tƣợng trên thì kết luận trong dịch chiết có nhóm poliphenol.
2.2.6. Pshƣơng pháp xác định thành phần hóa học trong dịch chiết cây nở ngày đất bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC - MS cây nở ngày đất bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC - MS
Bột thân và rễ cây Nở ngày đất đƣợc cân mỗi thứ 10g. Tiến hành chiết Soxhlet hai mẫu bột dƣợc liệu này với 4 dung môi n-hexane và ethylacetate, dichloromethane và methanol ở điều kiện chiết thích hợp. Dịch chiết thu đƣợc đem cô đuổi dung môi đến cắn. Gửi cắn của 8 dịch chiết này đến Trung tâm đo lƣờng chất lƣợng, số 2 Ngô Quyền, Thành phố Đà Nẵng để xác định thành phần hóa học bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ.
Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS) dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc ký khí với máy phổ khối lƣợng.
Sắc ký khí là một phƣơng pháp tách các cấu tử của hỗn hợp thành các cấu tử riêng biệt. Khối phổ là phƣơng pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm đƣợc ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dƣới chân không cao (10-6 mmHg). Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó đƣợc gia tốc trong một điện trƣờng, đƣợc tách trong một từ trƣờng theo tƣơng quan giữa khối lƣợng và điện tích của chúng và đƣợc ghi nhận theo cƣờng độ của các hạt đó.
Cấu tạo của máy GC - MS gồm hai phần: thiết bị sắc ký khí và thiết bị khối phổ đƣợc ghép với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bớt khí mang nhƣ H2, He để giảm áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký khí dùng mao quản, phần khối phổ sử dụng buồng ion hóa với bộ tách từ cực detector khối phổ.
2.2.7. Thử hoạt tính sinh học của cặn chiết cây nở ngày đất
Cân 10g bột thân cây nở ngày đất. Tiến hành chiết Soxhlet mẫu bột dƣợc liệu với dung môi chiết ở điều kiện chiết thích hợp. Dịch chiết thu đƣợc đem cô đuổi dung môi đến cắn. Gửi cắn của dịch chiết này đến phòng hóa sinh ứng dụng - Viện hóa học Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội để xác định hoạt tính sinh học. Trong phạm vi đề tài này, tôi đã thử hoạt tính kháng sinh và hoạt tính độc tế bào.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ TRONG CÂY NỞ NGÀY ĐẤT NỞ NGÀY ĐẤT
3.1.1. Độ ẩm
Bột cây nở ngày đất đƣợc sấy trong tủ sấy ở 105oC dƣới áp suất thƣờng đến khối lƣợng không đổi.
Kết quả 5 lần đo độ ẩm đƣợc trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm của cây nở ngày đất
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W (%) W trung bình (%) 1 47.681 5.012 52.251 8.818 8.816 2 42.214 5.005 46.777 8.831 3 43.832 5.020 48.410 8.804 4 48.214 5.009 52.781 8.824 5 48.835 5.021 53.414 8.803 Nhận xét:
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của mẫu cây nở ngày đất khô là 8.816%, đây là độ ẩm an toàn. Vì vậy, trong quá trình bảo quản cây có thể hạn chế được sự xâm nhập của các vi khuẩn, vi nấm giữ cho các hoạt chất trong cây ít bị thay đổi.
3.1.2. Hàm lƣợng tro
Lấy 5 mẫu cây nở ngày đất nung ở nhiệt độ 500oC trong thời gian từ 6 giờ. Hàm lƣợng tro chính là hàm lƣợng tro trung bình của 5 mẫu.
Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng tro cây nở ngày đất
STT m1(g) m2 (g) m3 (g) m tro tro (%) tro tb (%) 1 47.681 5.012 47.863 0.182 3.631 3.467 2 42.214 5.005 42.382 0.168 3.357 3 43.832 5.020 44.995 0.163 3.247 4 48.214 5.009 48.399 0.185 3.693 5 48.835 5.021 49.006 0.171 3.406 Nhận xét:
Từ Bảng 3.2 ta có hàm lượng tro trung bình trong bột cây nở ngày đất là 3.467%, đây chính là hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi tồn tại trong cây có thể có các muối của một số kim loại nặng như Fe, Cu, Pb, Zn …
3.1.3. Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại nặng
Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại nặng trong cây nở ngày đất đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng trong cây nở ngày đất
STT Tên kim loại Kết quả (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Pb 0,015 2,000 2 Cu 0,009 30,000 3 Hg - 0,050 4 As 0,005 1,000 Nhận xét:
Căn cứ vào quyết định của Bộ Y tế số 46/2007/QD-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh
học và hóa học trong thực phẩm với hàm lượng các kim loại nặng cho phép trong thực phẩm, đôí chiếu với mục hàm lượng kim loại cho phép trong rau quả và bảng kết quả trên ta nhận thấy hàm lượng kim loại nặng trong cây nở ngày đất thấp, là hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG THÂN CÂY NỞ NGÀY ĐẤT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET
3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết và xác định thành phần hóa học có trong thân cây nở ngày đất bằng dung môi n- hexane
a. Kết quả khảo sát thời gian chiết trong thân cây Nở ngày đất bằng