Hỗn hợp phản ứng là hỗn hợp lỏng-lỏng, rắn - lỏng cộng với dung môi hay tập hợp một số dung môi. Chúng có độ hoà tan khác nhau, nồng độ các chất khác nhau và có tác dụng tƣơng hỗ, khuếch tán vào nhau.
Dung môi cần đáp ứng những yêu cầu sau đây:
Phải có tính hoà tan chọn lọc, tức là hoà tan tốt các chất cần tách mà không đƣợc hoà tan hoặc hoà tan rất ít các chất khác. Đây là tính chất rất cơ bản không thể thiếu đƣợc.
Không có tác dụng hoá học với các cấu tử của dung dịch.
Nếu trích ly lỏng, yêu cầu khối lƣợng riêng () của dung môi khác xa với () dung dịch. Tất nhiên cũng có loại thiết bị trích ly dung dịch có rất gần nhau.
Không phá huỷ thiết bị.
Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản.
Không độc khi thao tác, không tạo hỗn hợp nổ với không khí và khó cháy. Rẻ tiền, dễ kiếm.
Dung môi phải đƣợc tách ra sau quá trình trích ly bằng phƣơng pháp đun nóng, chƣng cất, hoặc sấy. Sau khi tách không để lại mùi vị lạ và làm bẩn sản phẩm.
1.2.3. Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) [6], [7]
1.2.3.1. Định nghĩa
Cơ sở để tách sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha. Một pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn và pha động là khí thấm qua bề mặt pha tĩnh đó. Nếu pha tĩnh là rắn gọi là sắc kí khí rắn (gas solid chromatography – GSC), quá trình này chủ yếu là hấp phụ. Nếu pha tĩnh là lỏng có sắc kí khí – lỏng (gas liquid chromatography – GLC), chất lỏng bọc quanh một chất rắn trơ gọi là chất mang tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ sở cho sự tách ở đây chính là phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng.
1.2.3.2.Ứng dụng
Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C. Không biến đổi cấu trúc khi nhiệt lên đến dƣới 3000C;
Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp;
Đƣợc ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau.
1.2.3.3.Chu trình hoạt động
Mẫu (sample) phân tích đƣợc chạy theo chu trình hình 1.21 Đƣa vào bộ phận nạp mẫu (heated injector)
Di chuyển qua một cột phân tách (seperating column) nhờ một dòng khí mang trơ (inert carrier gas)
Phát hiện và ghi lại dƣới dạng các peaks khi các cấu tử đi ra khỏi cột.
Hệ thống tiêm mẫu
Có hai chế độ nạp mẫu :
- Không chia dòng (split): Cách thông dụng nhất là sử dụng một tiêm mẫu vi lƣợng (microsyringe) thƣờng dùng cột nhồi.
- Chia dòng (splitless): Cột mao quản đòi hỏi một lƣợng mẫu nhỏ hơn tiêm vào cột nên trong trƣờng hợp này sử dụng hệ thống chia dòng mẫu.
Cột sắc kí
Có nhiều cột tách khác nhau thỏa mãn mục đích nghiên cứu khác nhau
Cột nhồi (packed column): Chất hấp phụ nhồi vào cột. Sử dụng cho lƣợng mẫu lớn. Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Trong cột nhồi kích thƣớc hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Kích thƣớc hạt nhỏ cải thiện hiệu quả cột.
Cột mao quản (open-tubular): Pha tĩnh phủ vào mặt trong cột. Sử dụng dung lƣợng thấp mẫu. Cột mao quản có độ phân giải cao hơn, thời gian ngắn hơn độ nhạy cao hơn cột nhồi. Tuy nhiên cột mao quản nạp mẫu khó khăn.
Detector khối phổ (MS)
Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính, định lƣợng cho các chất sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng. Chất nghiên cứu đƣợc ion hoá trong pha khí ngƣng tụ dƣới chân không bằng những phƣơng pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này đƣợc phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e đƣợc ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cƣờng độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.Phổ khối lƣợng đƣợc ghi lại dƣới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cƣờng độ các vạch đƣợc đo bằng phần trăm so với đỉnh có cƣờng độ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thƣờng là đỉnh cao nhất, tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử của hợp chất khảo sát. [1]
Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ
phổ khối lƣợng (hình 1.22). Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp nhƣ không
khí, nƣớc…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống nhƣ việc lấy dấu vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó đƣợc so sánh với một thƣ viện cấu trúc các chất đã biết. Nếu không tìm ra đƣợc chất tƣơng ứng trong thƣ viện thì nhà
nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới Hình 1.22: Hệ thống GC-MS tìm đƣợc để phát triển các ý tƣởng về cấu trúc hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên
cứu thu đƣợc 1 dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thƣ viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này.
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất.
1.2.4. Thử hoạt tính sinh học
1.2.4.1. Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định [1]
Những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở ngƣời do ATCC cung cấp gồm:
Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thƣờng không gây bệnh.
Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
Escherichia coli: gram (-), gây một số bệnh về đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm dạ
dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
Pseudomonas aeruginosa: gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng
não, màng trong tim, viêm ruột.
Candida albicans: nấm men, thƣờng gây bệnh tƣa lƣỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
Lactobacillus fermentum: gram (+), là loại vi khuẩn đƣờng ruột lên men có
ích, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật.
Tiến hành nuôi cấy trong các môi trường: MHB (Mueller-Hinton Broth),
MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm.
Phương pháp thử: phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng
pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua giá trị thể hiện hoạt tính là IC50
(nồng độ ức chế 50%)
Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO và nƣớc cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 g/ml, tiếp theo là 32 g/ml, 8g/ml, 2g/ml, 0,5g/ml.
Chuẩn bị dung dịch thử vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml
Lấy 10l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã đƣợc pha loãng, thêm
200l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37oC. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thƣờng. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
1.2.4.2. Thử hoạt tính kháng oxi hóa
Phƣơng pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH) Phản ứng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shela G., M.B., Elena, K và cộng sự (2003). Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydratzyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp thụ ánh sáng của các của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch
thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bƣớc sóng 515nm. Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging Capacity)
Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu đƣợc đƣa vào chƣơng trình xữ lí số liệu Exel theo công thức: SC%= [ 100 – TN MT
AT OD OD OD x 100] ODTN: OD thí nghiệm ODMT: Mẫu trắng ODAT: OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducal nhƣ sau:
2 i (x x) n 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC50) sẽ đƣợc thử nghiệm bƣớc 2 để tìm giá trị SC50. Giá trị SC50 (g/ml).Mẫu đƣợc pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 đƣợc xác định bằng chƣơng trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50 % các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hòa chất thử.
Chƣơng 2
NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1. Thu nguyên liệu
Cây lấy tại xã Đức Nhuận, huyện Mộ Đức, tỉnh Quảng Ngãi (hình 2.1, 2.2)
Hình 2.1: Hoa cây sống đời Hình 2.2: Cây sống đời
Cách lấy lá: chọn lá còn nguyên không bị dập, rách. Lá còn mọng nƣớc, lá
màu xanh thẫm, mép và cuống lá màu tím. Hái lá vào buổi sáng .
Bảo quản: Lá đựng trong thùng giấy, không ẩm ƣớt và khi chuyên chở tránh va đập mạnh làm dập lá.
2.2. Xử lí nguyên liệu
Lá tƣơi: Nguyên liệu đƣợc chuẩn bị trƣớc mỗi lần chiết. Thu hái lá vào buổi sáng, lá tƣơi, màu xanh thẫm, loại lá còn non, lá vàng úa và những lá quá già. Loại bỏ sơ bộ những tạp chất bằng cách cho lá vào một chậu rửa lớn và cho nƣớc vào ngập lá. Dùng tay vuốt nhẹ hai mặt lá, rửa lại 3 lần rồi vớt lá ra rổ có lỗ to, để nghiên rổ để rút hết nƣớc nhanh chóng. Trong quá trình khuấy trộn chú ý không nên quá mạnh tay sẽ làm dập nát gây thất thoát các chất có trong lá. Không nên ngâm quá lâu vì làm lá thấm nƣớc, sau này sấy sẽ khó khăn.
Để hong khô lá nên thực hiện trong điều kiện thƣờng (hình 2.3). Dùng quạt để cho quá trình hong khô đƣợc nhanh hơn, do tạo ra sự đối lƣu không khí. Có nguyên liệu ta tiến hành cắt nhỏ để chƣng ninh và xác định độ ẩm lá tƣơi.
Lá khô : từ nguyên liệu lá tƣơi sau khi đã rửa sạch, vớt lá ra rổ có lỗ to, để nghiên rổ để rút hết nƣớc nhanh chóng. Ta đem phơi ngoài nắng gắt, thƣờng xuyên trở lá để
Hình 2.3: Lá sống đời đem hong khô
lá mau khô và khô đều. Phơi đến khi nào lá khô dòn và có thể xay đƣợc thì dừng. Để cho quá trình chiết sau này đƣợc thuận tiện, nhanh chóng, thực hiện công
đoạn xay thành bột để tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi hữu cơ. Công đoạn này tôi thực hiện bằng bộ phận xay rắn trong máy xay sinh tố. Bột lá không nên quá to vì quá trình chiết sẽ lâu và hiệu suất không cao, nhƣng bột lá cũng không nên quá mịn vì giữa chúng sẽ không có khoảng trống, dung môi khó tiếp xúc.
2.3. Xác định một số chỉ tiêu lý hóa Lá sống đời Lá sống đời Rửa sạch, hong khô Xác định độ ẩm Xác định hàm lƣợng tro Xác định hàm lƣợng kim loại Xác định các chỉ tiêu lý hóa
2.3.1. Xác định độ ẩm
2.3.1.1. Xác định độ ẩm lá tươi
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: cân khoảng 10g lá sống đời tƣơi đã hong khô cho vào chén sứ đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho chén sứ có chứa lá vào tủ sấy và sấy ở 100oC.
Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi chén sứ nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi.
2.3.1.2. Xác định độ ẩm lá khô
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: cân khoảng 5g lá sống đời khô đã đƣợc xay bột cho vào chén sứ đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho chén sứ có chứa lá vào tủ sấy và sấy ở 100o
C.
Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi chén sứ nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi.
2.3.2. Xác định hàm lượng tro trong lá sống đời
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: Cân khoảng 5g lá đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy
khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa lá vào lò nung và tăng dần nhiệt độ, nhiệt độ nung sau cùng ở 650oC. Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, ta thấy lá đã đƣợc tro hoá gần nhƣ hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau cân 30 phút ta tiến
hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá.
2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại
Dùng phƣơng pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định hàm lƣợng các kim loại: Pb, Cu, Zn, Fe, Cd trong lá cây sống đời.
Nguyên tắc của phép đo AAS: Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trƣờng hấp thụ.
Tiến hành: Tro thu đƣợc sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 đặc, định mức đến 250 ml, sau đó đi xác định hàm lƣợng kim loại. Mẫu đƣợc nguyên tử hóa bằng phƣơng pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là C2H2 – không khí. Gởi mẫu đến Đài khí tƣợng thủy văn khu vực trung trung bộ.
2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết
2.4.1. Khảo sát chiết chưng ninh bằng dung dịch KOH
2.4.1.1. Yếu tố thời gian
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến
hành chƣng ninh trong 2, 4, 6, 8 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy (hình 2.4). Lọc lấy dịch chiết .
Lấy 20 ml dịch chiết, cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc.
Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh
này vào tủ
Hình 2.4: Chƣng ninh bằng dung dịch KOH sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này
trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.1.2 Yếu tố rắn/lỏng
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50, 70, 90, 110, 130 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến hành chƣng ninh