Phƣơng pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH) Phản ứng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Shela G., M.B., Elena, K và cộng sự (2003). Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydratzyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp thụ ánh sáng của các của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch
thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bƣớc sóng 515nm. Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging Capacity)
Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu đƣợc đƣa vào chƣơng trình xữ lí số liệu Exel theo công thức: SC%= [ 100 – TN MT
AT OD OD OD x 100] ODTN: OD thí nghiệm ODMT: Mẫu trắng ODAT: OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducal nhƣ sau:
2 i (x x) n 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC50) sẽ đƣợc thử nghiệm bƣớc 2 để tìm giá trị SC50. Giá trị SC50 (g/ml).Mẫu đƣợc pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 đƣợc xác định bằng chƣơng trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50 % các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hòa chất thử.
Chƣơng 2
NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1. Thu nguyên liệu
Cây lấy tại xã Đức Nhuận, huyện Mộ Đức, tỉnh Quảng Ngãi (hình 2.1, 2.2)
Hình 2.1: Hoa cây sống đời Hình 2.2: Cây sống đời
Cách lấy lá: chọn lá còn nguyên không bị dập, rách. Lá còn mọng nƣớc, lá
màu xanh thẫm, mép và cuống lá màu tím. Hái lá vào buổi sáng .
Bảo quản: Lá đựng trong thùng giấy, không ẩm ƣớt và khi chuyên chở tránh va đập mạnh làm dập lá.
2.2. Xử lí nguyên liệu
Lá tƣơi: Nguyên liệu đƣợc chuẩn bị trƣớc mỗi lần chiết. Thu hái lá vào buổi sáng, lá tƣơi, màu xanh thẫm, loại lá còn non, lá vàng úa và những lá quá già. Loại bỏ sơ bộ những tạp chất bằng cách cho lá vào một chậu rửa lớn và cho nƣớc vào ngập lá. Dùng tay vuốt nhẹ hai mặt lá, rửa lại 3 lần rồi vớt lá ra rổ có lỗ to, để nghiên rổ để rút hết nƣớc nhanh chóng. Trong quá trình khuấy trộn chú ý không nên quá mạnh tay sẽ làm dập nát gây thất thoát các chất có trong lá. Không nên ngâm quá lâu vì làm lá thấm nƣớc, sau này sấy sẽ khó khăn.
Để hong khô lá nên thực hiện trong điều kiện thƣờng (hình 2.3). Dùng quạt để cho quá trình hong khô đƣợc nhanh hơn, do tạo ra sự đối lƣu không khí. Có nguyên liệu ta tiến hành cắt nhỏ để chƣng ninh và xác định độ ẩm lá tƣơi.
Lá khô : từ nguyên liệu lá tƣơi sau khi đã rửa sạch, vớt lá ra rổ có lỗ to, để nghiên rổ để rút hết nƣớc nhanh chóng. Ta đem phơi ngoài nắng gắt, thƣờng xuyên trở lá để
Hình 2.3: Lá sống đời đem hong khô
lá mau khô và khô đều. Phơi đến khi nào lá khô dòn và có thể xay đƣợc thì dừng. Để cho quá trình chiết sau này đƣợc thuận tiện, nhanh chóng, thực hiện công
đoạn xay thành bột để tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi hữu cơ. Công đoạn này tôi thực hiện bằng bộ phận xay rắn trong máy xay sinh tố. Bột lá không nên quá to vì quá trình chiết sẽ lâu và hiệu suất không cao, nhƣng bột lá cũng không nên quá mịn vì giữa chúng sẽ không có khoảng trống, dung môi khó tiếp xúc.
2.3. Xác định một số chỉ tiêu lý hóa Lá sống đời Lá sống đời Rửa sạch, hong khô Xác định độ ẩm Xác định hàm lƣợng tro Xác định hàm lƣợng kim loại Xác định các chỉ tiêu lý hóa
2.3.1. Xác định độ ẩm
2.3.1.1. Xác định độ ẩm lá tươi
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: cân khoảng 10g lá sống đời tƣơi đã hong khô cho vào chén sứ đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho chén sứ có chứa lá vào tủ sấy và sấy ở 100oC.
Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi chén sứ nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi.
2.3.1.2. Xác định độ ẩm lá khô
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứ để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: cân khoảng 5g lá sống đời khô đã đƣợc xay bột cho vào chén sứ đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho chén sứ có chứa lá vào tủ sấy và sấy ở 100o
C.
Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy chén ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi chén sứ nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi.
2.3.2. Xác định hàm lượng tro trong lá sống đời
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cách tiến hành: Cân khoảng 5g lá đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy
khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa lá vào lò nung và tăng dần nhiệt độ, nhiệt độ nung sau cùng ở 650oC. Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, ta thấy lá đã đƣợc tro hoá gần nhƣ hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau cân 30 phút ta tiến
hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá.
2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại
Dùng phƣơng pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định hàm lƣợng các kim loại: Pb, Cu, Zn, Fe, Cd trong lá cây sống đời.
Nguyên tắc của phép đo AAS: Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trƣờng hấp thụ.
Tiến hành: Tro thu đƣợc sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 đặc, định mức đến 250 ml, sau đó đi xác định hàm lƣợng kim loại. Mẫu đƣợc nguyên tử hóa bằng phƣơng pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là C2H2 – không khí. Gởi mẫu đến Đài khí tƣợng thủy văn khu vực trung trung bộ.
2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết
2.4.1. Khảo sát chiết chưng ninh bằng dung dịch KOH
2.4.1.1. Yếu tố thời gian
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến
hành chƣng ninh trong 2, 4, 6, 8 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy (hình 2.4). Lọc lấy dịch chiết .
Lấy 20 ml dịch chiết, cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc.
Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh
này vào tủ
Hình 2.4: Chƣng ninh bằng dung dịch KOH sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này
trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.1.2 Yếu tố rắn/lỏng
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50, 70, 90, 110, 130 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến hành chƣng ninh trong 4 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy. Lọc lấy dịch chiết.
Lấy 20 ml dịch chiết, cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự.
Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc. Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh này vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy
đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.2. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi hexan
2.4.2.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy (hình 2.5), thu lấy dịch chiết.
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cô
đuổi bớt dung môi rồi cho vào cốc Hình2.5: Chiết soxhlet với dung môi hexan
thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc.
đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.2.2. Yếu tố rắn/lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300 ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết.
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cô đuổi bớt dung môi rồi cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng của từng cốc. Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh này vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.3. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi clorofom
2.4.3.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách
thủy (hình 2.6), thu lấy dịch chiết. Hình 2.6: Chiết soxhlet với dung môi
clorofom
2.4.3.2. Yếu tố rắn /lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết. Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.4.4. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi metanol
2.4.4.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy (hình 2.7), thu lấy dịch chiết.
Hình 2.7: Chiết soxhlet với dung môi metanol
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.4.4.2. Yếu tố rắn/lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 6 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết. Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.5. Xác định thành phần hóa học
2.5.1. Chưng ninh mẫu lá tươi
Lấy 200g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 90 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến hành chƣng ninh trong 4 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy. Lọc lấy dịch chiết (hình 2.8), đem cô cạn dịch
Lá sống đời Đo GC-MS Cắt nhỏ Chƣng ninh Dung dịch KOH Đun cách thủy dịch chiết với etylbromua Dịch chiết Chiết lại với etylaxetat
chiết đến khi còn khoảng 20 ml dịch chiết. Cho khoảng 20 ml etylbromua vào, đun cách thủy trong 1giờ ở nhiệt độ 500C ta đƣợc dịch chiết. Lấy dịch chiết chiết lại với etylaxetat 3 lần trên phểu chiết, mỗi lần khoảng 20 ml etylaxetat (hình 2.9).
Hình 2.8: Dịch chiết chƣng ninh Hình 2.9: Dịch chiết chiết lại với dung môi KOH với etylaxetat
Rồi lấy phân đoạn phía trên, đem rửa lại với nƣớc 3 lần, mỗi lần khoảng 10 ml nƣớc để loại phần kiềm còn dƣ. Sau đó, làm khan với Na2SO4. Cô đuổi bớt dung môi. Lấy dịch chiết (hình 2.10) đi đo GC-MS. Đo GC-MS để xác định thành phần hóa học tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh.
2.5.2. Chiết soxhlet mẫu lá khô
2.5.2.1. Chiết soxhlet bằng dung môi hexan
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm200 ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết (hình 2.11) và bã (hình 2.12). Tiến hành cô đuổi bớt dung môi. Đem mẫu đi đo GC-MS.
Lá sống đời Rửa sạch Sấy khô Xay bột Chiết soxhlet Dịch chiết Xác định thành phần hóa học (bằng pp GC-MS)
Hình 2.11: Dịch chiết với dung môi hexan Hình 2.12: Bã chiết soxhlet với dung môi hexan
2.5.2.2. Chiết soxhlet bằng dung môi clorofom
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc sấy khô và xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 250 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng cách thủy, thu lấy dịch chiết (hình 2.13) và bã (hình 2.14). Tiến hành cô đuổi bớt dung môi.
Đem mẫu đi đo GC-MS
Hình 2.13: Dịch chiết với dung môi clorofom Hình 2.14: Bã chiết soxhlet với dung môi clorofom
2.5.2.3 Chiết soxhlet bằng dung môi metanol
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 6 giờ ở nhiệt độ