2.4.1. Khảo sát chiết chưng ninh bằng dung dịch KOH
2.4.1.1. Yếu tố thời gian
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến
hành chƣng ninh trong 2, 4, 6, 8 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy (hình 2.4). Lọc lấy dịch chiết .
Lấy 20 ml dịch chiết, cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc.
Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh
này vào tủ
Hình 2.4: Chƣng ninh bằng dung dịch KOH sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này
trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.1.2 Yếu tố rắn/lỏng
Lấy 200 g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 50, 70, 90, 110, 130 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến hành chƣng ninh trong 4 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy. Lọc lấy dịch chiết.
Lấy 20 ml dịch chiết, cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự.
Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc. Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh này vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy
đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.2. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi hexan
2.4.2.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy (hình 2.5), thu lấy dịch chiết.
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cô
đuổi bớt dung môi rồi cho vào cốc Hình2.5: Chiết soxhlet với dung môi hexan
thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng từng cốc.
đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.2.2. Yếu tố rắn/lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300 ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết.
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cô đuổi bớt dung môi rồi cho vào cốc thuỷ tinh chịu nhiệt có đánh số thứ tự. Trƣớc khi cho mẫu vào cốc thuỷ tinh, ta phải cân và ghi lại khối lƣợng của từng cốc. Lần lƣợt cho các cốc thuỷ tinh này vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 800C sấy đến khi thu đƣợc cao khô. Lấy cốc ra để nguội, cho vào bình hút ẩm cho tới khi đạt đƣợc nhiệt độ phòng. Cân lần lƣợt các cốc này trên cân phân tích và ghi lại khối lƣợng.
2.4.3. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi clorofom
2.4.3.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách
thủy (hình 2.6), thu lấy dịch chiết. Hình 2.6: Chiết soxhlet với dung môi
clorofom
2.4.3.2. Yếu tố rắn /lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết. Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.4.4. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi metanol
2.4.4.1. Yếu tố thời gian
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 4, 6, 8, 10 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy (hình 2.7), thu lấy dịch chiết.
Hình 2.7: Chiết soxhlet với dung môi metanol
Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.4.4.2. Yếu tố rắn/lỏng
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 100, 150, 200, 250, 300ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 6 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết. Lấy toàn bộ dịch chiết, đem cao khô, cân lƣợng cao trên cân phân tích.
2.5. Xác định thành phần hóa học
2.5.1. Chưng ninh mẫu lá tươi
Lấy 200g lá tƣơi cắt nhỏ cho vào bình cầu 500 ml, sau đó cho 90 ml KOH 0,05N vào bình cầu, lắp hệ thống sinh hàn. Tiến hành chƣng ninh trong 4 giờ ở nhiệt độ 800C trên bếp cách thủy. Lọc lấy dịch chiết (hình 2.8), đem cô cạn dịch
Lá sống đời Đo GC-MS Cắt nhỏ Chƣng ninh Dung dịch KOH Đun cách thủy dịch chiết với etylbromua Dịch chiết Chiết lại với etylaxetat
chiết đến khi còn khoảng 20 ml dịch chiết. Cho khoảng 20 ml etylbromua vào, đun cách thủy trong 1giờ ở nhiệt độ 500C ta đƣợc dịch chiết. Lấy dịch chiết chiết lại với etylaxetat 3 lần trên phểu chiết, mỗi lần khoảng 20 ml etylaxetat (hình 2.9).
Hình 2.8: Dịch chiết chƣng ninh Hình 2.9: Dịch chiết chiết lại với dung môi KOH với etylaxetat
Rồi lấy phân đoạn phía trên, đem rửa lại với nƣớc 3 lần, mỗi lần khoảng 10 ml nƣớc để loại phần kiềm còn dƣ. Sau đó, làm khan với Na2SO4. Cô đuổi bớt dung môi. Lấy dịch chiết (hình 2.10) đi đo GC-MS. Đo GC-MS để xác định thành phần hóa học tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh.
2.5.2. Chiết soxhlet mẫu lá khô
2.5.2.1. Chiết soxhlet bằng dung môi hexan
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm200 ml hexan vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng bếp cách thủy, thu lấy dịch chiết (hình 2.11) và bã (hình 2.12). Tiến hành cô đuổi bớt dung môi. Đem mẫu đi đo GC-MS.
Lá sống đời Rửa sạch Sấy khô Xay bột Chiết soxhlet Dịch chiết Xác định thành phần hóa học (bằng pp GC-MS)
Hình 2.11: Dịch chiết với dung môi hexan Hình 2.12: Bã chiết soxhlet với dung môi hexan
2.5.2.2. Chiết soxhlet bằng dung môi clorofom
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc sấy khô và xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 250 ml clorofom vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 8 giờ ở nhiệt độ 800C bằng cách thủy, thu lấy dịch chiết (hình 2.13) và bã (hình 2.14). Tiến hành cô đuổi bớt dung môi.
Đem mẫu đi đo GC-MS
Hình 2.13: Dịch chiết với dung môi clorofom Hình 2.14: Bã chiết soxhlet với dung môi clorofom
2.5.2.3 Chiết soxhlet bằng dung môi metanol
Cân trên cân phân tích khoảng 20g mẫu lá khô đã đƣợc xay bột, bọc bột lá bằng giấy lọc cho vào phần thân hệ thống soxhlet. Thêm 150 ml metanol vào bình cầu thủy tinh 500 ml đã rửa sạch, sấy khô, lắp phần thân hệ thống soxhlet, lắp hệ thống sinh hàn của thệ thống soxhlet, lắp dụng cụ, thực hiện trong 6 giờ ở nhiệt độ 800C bằng cách thủy, thu lấy dịch chiết (hình 2.15) và bã (hình 2.16). Tiến hành cô đuổi bớt dung môi. Đem mẫu đi đo GC-MS.
Hình 2.15: Dịch chiết với dung môi metanol Hình 2.16: Bã chiết soxhlet với dung môi metanol 2.6. Thử hoạt tính sinh học Chƣng ninh Dịch chiết Chiết soxhlet Thử hoạt tính sinh học Lá sống đời
2.6.1. Thử hoạt tính kháng sinh
Mẫu 1: Dịch chiết lá cây sống đời tƣơi chƣng ninh trong dung môi nƣớc Mẫu 2: Dịch chiết lá cây sống đời khô chiết soxhlet bằng dung môi clorofom
Thử hoạt tính kháng sinh (6 mẫu vi khuẩn và 1 mẫu nấm) của dịch chiết lá cây sống đời .
2.6.2. Thử hoạt tính kháng oxi hóa
Mẫu 1: Dịch chiết lá cây sống đời tƣơi chiết lại trong etylaxetat.
Mẫu 2: Dịch chiết lá cây sống đời khô chiết soxhlet bằng dung môi hexan. Mẫu 2: Dịch chiết lá cây sống đời khô chiết soxhlet bằng dung môi metanol.
Thử hoạt tính kháng DPPH của 3 mẫu dịch chiết lá cây sống đời.
Thử hoạt tính kháng sinh và kháng oxi hóa của dịch chiết lá cây sống đời tại phòng thử hoạt tính sinh học - Viện hóa học.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu lý hóa
3.1.1. Xác định độ ẩm
3.1.1.1. Xác định độ ẩm lá tươi
Nguyên liệu đã đƣợc xử lí trình bày ở mục 2.2
Ta tính đƣợc độ ẩm lá tƣơi dựa vào công thức mục 1.2.1.1. Kết quả độ ẩm lá tƣơi khảo sát đƣợc thống kê trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong lá sống đời tươi
Mẫu m (g) m1 (g) m2 (g) (%) (%) 1 10,025 82,037 82,756 92,828 92,777 2 10,011 96,453 97,176 92,778 3 10,022 91,120 91,849 92,726 Trong đó: - : độ ẩm (%)
- m: khối lƣợng lá trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng chén sứ (g)
- m2: khối lƣợng chén sứ và lá sau khi sấy (g)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình trong lá sống đời tƣơi là: 92,777 %
Lá sống đời tƣơi có độ ẩm rất cao ảnh hƣởng đến việc bảo quản do đó cần phải đƣợc sấy khô.
Độ ẩm trong lá rất cao do đó cây sống đời có thể sống ở những vùng khô hạn vì trong lá có dự trữ một lƣợng nƣớc khá lớn.
3.1.1.2. Xác định độ ẩm lá khô
Nguyên liệu đã đƣợc làm khô trình bày ở mục 2.2. Ta tính đƣợc độ ẩm lá khô dựa vào công thức mục 1.2.1.1
Bảng 3.2: Kết quả xác định độ ẩm trong lá sống đời khô Mẫu m (g) m1 (g) m2 (g) (%) (%) 1 5,006 86,347 90,640 14,243 14,338 2 5,003 98,267 102,552 14,351 3 5,007 100,981 105,266 14,420 Trong đó: - : độ ẩm (%)
- m: khối lƣợng lá trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng chén sứ (g)
- m2: khối lƣợng chén sứ và lá sau khi sấy (g)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình trong lá khô là:14,338 %
Ta sử dụng lá khô đƣợc phơi tới độ ẩm là 14,338 %, độ ẩm vừa phải không ảnh hƣởng nhiều đến việc bảo quản và quá trình chiết.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro trong lá sống đời
Hàm lƣợng tro trong lá khô đƣợc tính theo công thức mục 1.2.1.1. Kết quả hàm lƣợng tro đƣợc thống kê trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá sống đời sấy khô
Mẫu m(g) m1 (g) m2 (g) H (%) H (%) 1 5,009 49,984 50,037 1,058 1,073 2 5,016 50,401 50,447 0,917 3 5,020 51,748 51,811 1,255
H : hàm lƣợng tro trong lá sấy khô (%) Trong đó: m : khối lƣợng lá khô trƣớc khi tro hoá (g) m1 : khối lƣợng cốc (g)
m2 : khối lƣợng cốc và mẫu sau khi tro hóa (g)
Nhận xét: Hàm lƣợng tro trung bình trong lá sống đời là : 1,073 %.
Mẫu lá sống đời sau khi tro hoá đƣợc hoà tan bằng dung dịch HNO3 đặc. Lấy dung dịch trên định mức đến 250 ml đem đi xác định hàm lƣợng một số kim loại. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Bảng hàm lượng một số kim loại trong lá cây sống đời
Kim loại Chỉ tiêu Hàm lƣợng (mg/l) Hàm lƣợng (mg/kg) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) Zn TCVN 6193:1996 5,0023 7,0088 40 Pb TCVN 6193:1996 0,5655 0,7923 2 Cu TCVN 6193:1996 0,6527 0,9145 30 Fe TCVN 6177:1996 10,0720 14,1120 - Cd TCVN 6193:1996 0,0198 0,0277 1
Căn cứ vào quyết định số 867/1998/ QĐ-BYT ngày 04 tháng 4 năm 1998 của Bộ y tế về việc ban hành ”Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực thực phẩm”, đối chiếu với mục hàm lƣợng kim loại cho phép trong rau quả và bảng kết quả trên ta nhận thấy thành phần kim loại trong lá cây sống đời có hàm lƣợng nhỏ, sẽ không gây độc hại đến quá trình nghiên cứu và sử dụng.
3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết
3.2.1. Khảo sát chiết chưng ninh bằng dung dịch KOH
3.2.1.1. Yếu tố thời gian
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát yếu tố thời gian trong chiết chƣng ninh bằng dung dịch KOH Mẫu Khối lƣợng lá (g) Thời gian chiết (giờ) Thể tích dung dịch KOH (ml) Thể tích dịch chiết đem cao khô Khối lƣợng cao thu đƣợc (g) 1 200,007 2 50 20 0,085 2 200,012 4 50 20 0,163 3 200,019 6 50 20 0,144 4 200,021 8 50 20 0,129
Sau khi khảo sát yếu tố thời gian ta thấy với 200 g mẫu lá tƣơi chƣng ninh trong dung dịch KOH với cùng thể tích là 50 ml ta thấy ở thời gian 4 giờ là thích hợp. Do đó ta cố định thời gian 4 giờ để khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng thích hợp ở các thể tích dung dịch KOH là 50, 70, 90, 110, 130 ml.
3.2.1.2. Yếu tố rắn/lỏng
Kết quả khối lƣợng cao thu đƣợc trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát yếu tố rắn/lỏng trong chiết chƣng ninh bằng dung dịch KOH Mẫu Khối lƣợng lá (g) Thời gian chiết (giờ) Thể tích dung dịch KOH (ml) Thể tích dịch chiết đem cao khô Khối lƣợng cao thu đƣợc (g) 1 200,012 4 50 20 0,163 2 200,011 4 70 20 0,195 3 200,008 4 90 20 0,214 4 200,015 4 110 20 0,212 5 200,017 4 130 20 0,206
Sau khi khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng ta thấy với 200 g mẫu lá tƣơi chƣng ninh trong dung dịch KOH với các thể tích là 50, 70, 90, 110, 130 ml ta thấy ở tỉ lệ 200 lá tƣơi/90 ml dung dịch KOH là thích hợp . Nhƣ vậy sau khi khảo sát yếu tố thời gian và tỉ lệ rắn/lỏng, ta chọn chƣng ninh 200g lá sống đời tƣơi trong 90 ml dung dịch KOH trong thời gian 4 giờ.
3.2.2. Khảo sát chiết soxhlet bằng dung môi hexan
3.2.2.1. Yếu tố thời gian
Kết quả khối lƣợng cao thu đƣợc trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát yếu tố thời gian trong chiết soxhlet bằng dung môi hexan Mẫu Khối lƣợng lá (g) Thời gian chiết (giờ) Thể tích dung môi (ml)
Khối lƣợng cao thu đƣợc (g)
1 20,011 4 150 0,115
2 20,032 6 150 0,157
3 20,027 8 150 0,192
4 20,049 10 150 0,192
Sau khi khảo sát yếu tố thời gian ta thấy với 20 g mẫu lá khô chiết soxhlet