6. Bố cục luận văn
2.3.6. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào
Phƣơng pháp: phƣơng pháp thử độ độc tế bào in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro.
Xác định hoạt tính độc tế bào trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm bao gồm: HepG2 (ung thƣ gan), MCF7 (ung thƣ vú) và Hela (ung thƣ cổ tử cung), MKN7 (ung thƣ dạ dày).
Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ và không ung thƣ in vitro của các mẫu chiết, cũng nhƣ để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thƣ và không ung thƣ. Phép thử này, dựa vào khả năng của Sulforhodamine B (SRB) bám vào protein của tế bào đã đƣợc cố định bởi axit trichloroaxetic (TCA), SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng
nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ và tách ra trong điều kiện kiềm, lƣợng chất màu tách ra từ tế bào đƣợc nhuộm là tƣơng ứng với số lƣợng tế bào.
Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trên phiến vi lƣợng 96 giếng. Phản ứng SRB đƣợc chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể đƣợc lƣu giữ lâu dài, chất mầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng nhƣ trong nghiên cứu.
Phƣơng pháp thử độ độc tế bào in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro. Phép thử này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Monks [35]. Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Giá trị phần trăm sống sót CS % (Cell Survival) là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo công thức:
[
]
Độ lệch σ đƣợc tính theo công thức: √ ∑ ̅
Trong đó:
OD: mật độ quang; σ: độ lệch tiêu chuẩn; Xi : giá trị OD tại giếng i;
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm để tìm giá trị IC50.