6. Bố cục luận văn
3.1.1. Thành phần của pectin
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của cây cúc quỳ
Độ ẩm (%) 3,74 0,22 Tro (%) 4,98 0,88 Protein (%) 3,32 0,15 Chất béo (%) 1,77 0,32 Đƣờng (% w/w) 85,78 2,15 Bảng 3.2. Thành phần mono saccharide (%) Mannose 3,11 0,15 Glucorunic acid 1,15 0,71 Xylose 3,08 0,37 Galacturonic acid 47,59 0,59 Rhamnose 23,94 0,91 Galactose 3,04 0,11 Glucose 3,29 0,16 Arabinose 11,14 0,91 Fucose 0,57 0,08
Thành phần hóa học của mẫu phân lập từ cây cúc quỳ (TDP) đƣợc thể hiện trong bảng 3.1. Tổng hàm lƣợng đƣờng trong mẫu phân lập đƣợc từ cây cúc quỳ là 85,78%, kết luận rằng cacbohydrat là thành phần chính trong TDP.
Sắc kí đồ HPLC của dung dịch thủy phân TDP đƣợc trình bày trên hình 3.1 Các pic trên sắc kí đồ đƣợc xác định thông qua việc so sánh với thời gian lƣu của monosaccharide chuẩn đã đƣợc xây dựng từ trƣớc. Thành phần monosaccharide của TDP phân lập từ cây cúc quỳ đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Kết quả phân tích này tƣơng đồng với một số tác giả chỉ ra rằng monosaccharide chính trong polysaccharides từ thành tế bào là axit galacturonic, tiếp theo là rhamnose [14], [25]. Hàm lƣợng lớn axit galacturonic và rhamnose cho thấy sự có mặt của homogalacturonan và rhamnogalacturonan trong TDP. Sự có mặt đáng kể của arabinose chỉ ra sự tồn tại của các chuỗi arabinan trên mạch nhánh. Ngoài ra, một lƣợng đáng kể arabinose có thể chứng minh sự tồn tại của arabinan phân nhánh cao trong mạch của TDP. Kết quả này cho phép khẳng định TDP phân lập từ cây cúc quỳ có thành phần cấu trúc của pectin.
Hình 3.1. Sắc kí đồ HPLC của dịch thủy phân mẫu TDP 3.1.2. Phổ hồng ngoại của TDP
Phổ hồng ngoại của TDP phân lập từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.2. Đối với pectin, vùng dao động trong khoảng 1200-1800 cm-1
trên phổ IR đƣợc xem là vùng “vân tay” của mẫu. Tại đây, ta có thể quan sát trạng thái đặc trƣng của các nhóm carboxylic (khoảng 1750-1350 cm-1) [33]. Dải dao động ở vùng 1733 cm- 1
đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm C=O của gốc carboxylic acid không đƣợc ion hóa (tồn tại dƣới dạng methyl hóa hay gốc acid). Sự ion hóa gốc này (tạo thành muối) dẫn đến việc suy giảm tín hiệu này trên phổ và làm xuất hiện tín hiệu dao động hóa trị của COO-
tƣơng ứng trong vùng 1600-1650 (bất đối xứng) và 1400-1450cm-1 (đối xứng) [33].
Hình 3.2. Phổ hồng ngoại của pectin từ cây cúc quỳ
Mức độ ester hóa (DE) đƣợc định nghĩa là tỷ số giữa số lƣợng nhóm ester so với tổng số nhóm acid và nhóm ester và đƣợc đánh giá trực quan thông qua cƣờng độ tín hiệu của dải 1733 cm-1
. Hình 3.2 cho thấy pectin thu đƣợc từ cây cúc quỳ là loại pectin có mức độ este hóa (mức độ methyl hóa) thấp.
3.1.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR và 13C NMR của TDP
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của mẫu TDP thu đƣợc từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của mẫu pectin thu đƣợc từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 2 có rất nhiều điểm tƣơng đồng với phổ 1H- NMR của polysaccharide giàu arabinan phân lập từ Opuntia ficus-indica [53]. Vùng các tín hiệu anome trên phổ cho thấy các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 5,18, 5,03 và 5,01 đƣợc gán tƣơng ứng cho α-(1→5) arabinofuranosyl, α-(1→2) rhamnopyranosyl, và α- (1→4)-galactopyranosylacid. Sự có mặt của proton H6 của các đơn vị rhamnose thể hiện qua các tín hiệu cộng hƣởng ở độ dịch chuyển 1,12 và 1,23. Tín hiệu ở 1,12 ppm tƣơng ứng với gốc rhamnose liên kết (1 →2) với một galacturonic acid còn tín hiệu ở 1,23 ppm là của gốc rhamnose liên kết (2 →1) với một galacturonic acid và tạo nhánh ở O-4. Tín hiệu có cƣờng độ cao ở 3,70 ppm là tín hiệu của nhóm methyl liên kết với gốc GalA. Kết quả thu đƣợc hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin
chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA). Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin trong khi các đƣờng khác nhƣ arabinose (Ara), galactose (Gal), và xylose (Xyl) nằm trên các mạch nhánh [53].
Hình 3.4. Phổ13C NMR của TDP từ cây cúc quỳ
Trên hình 3.4, phổ 13C NMR của pectin cho thấy các tín hiệu anome đặc trƣng của rhamnose và glacturonic acid trong các khối cấu tạo của mạch chính rhamnogalacturonan ở 100,1 và 98,6 ppm đƣợc gán tƣơng ứng cho C1 của các đơn vị (1→2)- rhamnose và (1 →4)-galacturonic acid. Các tín hiệu ở 175,9 và 175,2 ppm đặc trƣng cho các nhóm chức carboxylic C6 tƣơng ứng của các đơn vị (1 →4)- galacturonicacid và galacturonicacid(1→2)-rhamnose. Trong khi đó, tín hiệu ở 17,2 ppm đặc trƣng cho các nhóm methyl của các đơn vị rhamnose. Bên cạnh đó, phổ 13C NMR của pectin còn thể hiện những tín hiệu đặc trƣng của các đơn vị (1 →5) arabinose qua các cộng hƣởng có độ dịch chuyển hóa học 108,5, 83,4, 78,3,84,9 và 67,6 ppm tƣơng ứng với C-1 − C-5.
Kết quả thu đƣợc cho thấy pectin từ cúc quỳ là loại pectin giàu arabinan với các dữ liệu phổ phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA). Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin và arabinose (Ara) là thành phần đƣờng có hàm lƣợng đáng kể ở mạch nhánh [19], [53].
Sắc kí đồ thẩm thấu gel của mẫu pectin đƣợc trình bày trên hình 3.5.
Kết quả GPC của mẫu pectin cho phép xác định các thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lƣợng phân tử trung bình Mw = 1,39 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình số Mn = 1,15 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình Mz = 1,74 x 104 g/mol và đặc trƣngvề chỉ số phân tán PDI = MW/Mn = 1,2. Điều này cho thấy độ phân tán khối lƣợng của pectin từ cúc quỳ có tƣơng đối nhỏ.
.
Hình 3.5. Sắc kí đồ thẩm thấu gel - GPC của mẫu TDP từ cây cúc quỳ 3.1.5. Hoạt tính chống oxi hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.6.
Khi nồng độ pectin tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin tăng dần và đạt đến 88% khi nồng độ pectin đạt 10 mg/ml. Giá trị IC50 tƣơng ứng của pectin và vitamin C lần lƣợt là 4,73 mg/ml và 1,30 mg/ml. Kết quả này cho thấy có thể xem pectin là một nguồn chất chống oxi hóa từ tự nhiên đầy hứa hẹn.
Hình 3.6. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của TDP từ cúc quỳ 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SULFAT HÓA TỪ PECTIN
3.2.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Sulfat hóa
Khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng (Mw), khối lƣợng phân tử trung bình số(Mn), khối lƣợng phân tử trung bình z (Mz) và đặc trƣng về chỉ số phân tán PDI = MW/Mn của các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khối lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Sulfat hóa và hàm lƣợng Sulfat
Mẫu Hàm lƣợng DS Mw x 104 Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
Pectin 0 1,39 1,15 1,74 1,21
Pectin Sulfat hóa 1 (TDP-S1)
15,20 2,45 1,90 3,23 1,28
Pectin Sulfat hóa 2 (TDP-S2)
18,31 1,45 1,69 1,26 1,15
Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Sulfat hóa có giá trị DS và trọng lƣợng phân tử khác nhau thu đƣợc bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng.
Giá trị Mw của các mẫu Sulfat hóa cũng tăng nhẹ so với pectin ban đầu. Điều này có thể là do các gốc hydroxyl trong phân tử pectin đã đƣợc thay thế bằng
0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 12 H o ạt tính q u é t gố c h yd ro xy l t ự d o (% ) Nồng độ (mg/ml) Pectin Vitamin C
các gốc Sulfat. Tuy nhiên so với mẫu TDP-S1 (thời gian phản ứng 30 phút), mẫu TDP-S2 (thời gian phản ứng 90 phút) có các giá trị Mw, Mn, Mz và Mw/Mn giảm đi nhƣng hàm lƣợng DS tăng lên, điều này có thể giải thích là khi thời gian phản ứng Sulfat hóa tăng, một mặt giúp tăng hàm lƣợng Sulfat trong dẫn xuất nhƣng mặt khác lại thủy phân một phần phân tử.
Hình 3.7. Phổ FT-IR của mẫu TDP (trên) và TDP-S (dƣới)
Phổ IR của TDP và TDP-S đƣợc trình bày trên Hình 3.7. So sánh hai phổ này, chúng tôi thấy rằng, phổ của TDP-S thể hiện sự xuất hiện mới của tín hiệu hấp thụ tại vùng 800-880cm-1 đặc trƣng cho nhóm Sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự
giảm cƣờng độ hấp thụ của tín hiệu tại ~3261-3370cm-1 là đặc trƣng cho dao động của nhóm OH.
So sánh phổ 13C-NMR của TDP và TDP-S (Hình 3.8), ta thấy trên phổ 13C- NMR của TDP-S xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ chuyển dịch hóa học ở δ=77,2 ppm, đƣợc gán cho carbon ở vị trí C-2 của rhamnose, có sự dịch về phía trƣờng thấp hơn so với tín hiệu C-2 của vị trí carbon không thế, điều đó chứng tỏ mẫu TDP-S bị Sulfate hóa tại vị trí C-2 của rhamnose.
Hình 3.8. Phổ 13 C-NMR của các mẫu TDP (trên) so với TDP-S (dƣới)
Nhƣ vậy, các phân tích cấu trúc trên đây cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã đƣợc thực hiện.
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ và dẫn xuất Sulfat hóa đƣợc trình bày trên hình 3.9.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – 5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-S tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP- S1 là cao nhất so với pectin và TDP-S2. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 lần lƣợt là 55,3, và 47,8% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá trình Sulfat hóa giúp tăng cƣờng hoạt tính chống oxy hóa của pectin.
Hình 3.9. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Sulfat hóa
3.2.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thƣ của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa Sulfat hóa
Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 và TDP đƣợc khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào MKN7. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trên bảng 3.4.
0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 S c a v e n g ing e ff e c t( %) Concentration (mg/mL) TDP TDP-S1 TDP-S2 Vitamin C
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ MKN7 của các mẫu TDP và TDP-S Nồng độ (µg/ml) TDP-S1 TDP-S2 TDP Nồng độ (µg/ml) Ellipticine 400 49,02 46,35 45,96 10 96,47 200 22,07 28,31 22,13 2 90,28 100 10,12 17,74 10,79 0,4 55,11 50 -2,25 8,32 3,7 0,08 19,79 IC50 >100 >100 >100 IC50 0.35 ± 0.03
Kết quả cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin có tác dụng tăng hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thƣ MKN7 không đáng kể so với polysaccharide ban đầu. Điều này đặt ra yêu cầu cần tìm con đƣờng tạo dẫn xuất để nâng cao hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hiệu quả hơn. Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tiếp tục triển khai quá trình tạo dẫn xuất Selen hóa pectin.
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SELEN HÓA TỪ PECTIN 3.3.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Selen hóa 3.3.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Selen hóa
Khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng (Mw), khối lƣợng phân tử trung bình số(Mn), khối lƣợng phân tử trung bình z(Mz), độ phân tán (PDI, Mw / Mn) cho tất cả các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 3.5. Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Selen hóa có hàm lƣợng Se và trọng lƣợng phân tử khác nhau thu đƣợc bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu dẫn xuất có độ phân tán tăng nhẹ so với pectin không đƣợc Selen hóa.
Bảng 3.5. Khối lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Selen hóa
Mẫu Hàm lƣợng
Se (μg/g) Mw x 10
4
Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
Pectin 0 1,39 1,15 1,74 1,21
Pectin Selen hóa 1 1887 2,47 1,90 3,23 1,30
Pectin Selen hóa 2 1695 2,45 1,92 3,20 1,28
Giá trị Mw tăng có thể là do các -OH mà đã đƣợc thay thế bởi [28]. Vì vậy, có thể giả định rằng Mw của các mẫu pectin Selen hóa cao hơn có thể là do sự hiện diện của các nhóm chức chứa Selen mới thêm vào thay thế nhóm hydroxyl trong pectin.
Hình 3.10. Phổ FT-IR của TDP (trên) và dẫn xuất pectin Selen hóa TDP-Se (dƣới)
Phổ FT-IR của pectin và dẫn xuất pectin Selen hóa khá tƣơng đồng đƣợc minh họa trong Hình 3.11. Đỉnh khoảng 3400 và 2930 cm-1 trong TDP và Se-TDP tƣơng ứng sự hấp thụ C-H và dao động kéo dài O-H. Các dao động thuộc vùng từ 2200 đến 950 cm-1, đƣợc coi là "dấu vân tay" của cacbohydrat, đặc trƣng cho từng
loại polysaccharide [26]. Các dải 1722 và 1651 cm-1 đƣợc quy kết tƣơng ứng với nhóm cacbonyl (C = O) dao động hóa trị của các nhóm methyl este hóa và không este hóa và carboxyl pectin. Đặc biệt, so sánh phổ hồng ngoại của pectin và pectin Selen hóa cho thấy, trên phổ của dẫn xuất Selen hóa xuất hiện thêm một dải hấp thụ ở 640 cm-1, trong khi đó vạch hấp thụ này không xuất hiện trong phổ của TDP. Theo nghiên cứu trƣớc đây [41], dải đặc trƣng giữa 600 - 700 cm-1 biểu hiện dao động kéo dài Se-O-C bất đối xứng. Điều này chứng tỏ rằng dẫn xuất pectin Selen hóa đã đƣợc tổng hợp thành công theo quy trình. Qua so sánh Phổ 13
C NMR của mẫu TPD-Se hoàn toàn giống phổ 13C NMR của mẫu TDP-S, nên chúng tôi tiến hành khảo sát thêm phổ khối lƣợng của mẫu TDP-Se so với mẫu TDP.
Nhƣ đã biết, phổ khối lƣợng ESI-MS là một trong những công cụ nghiên cứu cấu trúc hữu hiệu đối với các hợp chất hữu cơ nói chung và các polysaccharide nói riêng. Con đƣờng phân mảnh chính để tạo nên các ion trong quá trình ion hóa các phân tử polysaccharide dựa trên sự phân ly của liên kết C-O giữa các đơn vị saccharide của chuỗi phân tử [24]. Trong phổ MS của TDP (Hình 3.11), đỉnh cơ bản (đỉnh có cƣờng độ cao nhất) tại m/z 177 và đỉnh tại m/z 189 chỉ ra rằng axit galacturonic là thành phần chính trong phân tử TDP. Thêm vào đó, đỉnh 358 chỉ ra sự tồn tại của các đơn vị rhamnose galacturonic liên kết trong phân tử.Trong phổ này, đỉnh tại m/z 475 có cƣờng độ thấp đƣợc gán cho phân mảnh [(GalA - OH + Na) RhaAra] + cho thấy sự thay thế của arabinose ở các chuỗi bên trái của xƣơng sống rhamnogalacturonan. Tuy nhiên, trong phổ MS của TDP-Se (Hình 3.12), đỉnh m/z 475 này có cƣờng độ cao nhất là do sự góp mặt đáng kể của ion mới [(GalA-O) (NaSeO3) Rha + H+]. Bên cạnh đó, trên phổ Se-TDP còn xuất hiện một số ion mới trong nhƣ 521, 645, điều này không chỉ chứng minh sự thành công của quá trình Selenyl hóa mà còn khẳng định mối liên kết homogalacturan và rhamnogalacturonan của TDP (Bảng 3.6.). Nói tóm lại, các kết quả trên đã chứng minh rằng các nhóm Selenyl đã đƣợc thay thế thành công trên TDP trong quá trình Selenyl hóa.
Hình 3.11. Phổ ESI-MS của mẫu TDP
Bảng 3.6. Các phân mảnh chính trên phổ khối ESI-MS của các mẫu pectin và pectin Selen hóa
m/z Phân mảnh TDP TDP- Se1 TDP- Se2 TDP- Se3 177 [GalA – OH]+ x x x x
189 [GalA –CO + Na]+ x x x x
340 [GalARha ]+ x x x
358 [GalARha + H2O]+ x x x x
475 [(GalA – O –H+ +Na+)RhaAra ]+ x x x x [{(GalA–O )(NaSeO3)} Rha +H+ ]+ x x x 521 [GalA{(GalA–OH) (NaSeO3)} + H2O]+ x x x
534 [GalAGalARha + H2O]+ x x x x
645 [GalA{(GalA-OH)(NaSeO3)}Rha – Na+ + H3O]+
x x x
3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin và dẫn xuất Selen hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ và các dẫn xuất Selen hóa đƣợc trình bày trên hình 3.14.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – 5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-Se tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu