6. Bố cục luận văn
2.4.2. Tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin
Hình 2.4. Quy trình tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin 2.4.3. Tổng hợp dẫn xuất Selen hóa từ pectin
Na2SO4 (loại bỏ ion Ba2+) phân tán và khuấy trong HNO3 trong 10h ở nhiệt độ phòng
rửa và hòa tan lại trong nƣớc
thẩm tách dƣới dòng nƣớc chảy trong 48h Etanol (95%)
khuấy đều trong 6h
làm nguội đến nhiệt độ phòng
pH đƣợc điều chỉnh về 7–8 bằng NaOH 1M Pectin tinh khiết
Hỗn hợp Hỗn hợp Hỗn hợp Kết tủa H2SeO3 và BaCl2 (tỷ lệ mol 1: 1)
Dẫn xuất selen hóa
Etanol (95%) Pectin tinh khiết
Trung hòa bằng dung dịch NaOH Hỗn hợp
Thêm (NH4)2SO4 vào và khuấy trong 10 phút axit sulfuric đặc và butanol
(tỷ lệ mol 3:1) trong bể nƣớc đá Thêm từ từ và
khuấy đều trong 3h ở 10oC
Hỗn hợp
kết tủa
rửa và hòa tan lại trong nƣớc
thẩm tách dƣới dòng nƣớc chảy trong 48h Dẫn xuất Sulfat hóa
2.5. QUY TRÌNH TỔNG HỢP
2.5.1. Phân lập và tinh chế pectin
Mẫu thực vật sau khi thu hái đƣợc thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-450C, sau đó đem nghiền nhỏ. 100 g bột cúc quỳ đƣợc ngâm chiết với 2 lít etanol (12h)x3 lần để loại bỏ chất béo, các chất hữu cơ phân tử lƣợng thấp. Mẫu thực vật sau khi loại bỏ chất béo và các chất hữu cơ phân tử lƣợng thấp đƣợc đun với 2 lít nƣớc cất trong 3h (3 lần).
Hình 2.6. Dung dịch chiết đƣợc cô đuổi dung môi
Các dung dịch đƣợc cô đặc bằng cách cô đuổi dung môi sau đó đƣợc kết tủa bằng etanol với tỷ lệ thể tích 3:1. Tiếp tục tiến hành ly tâm, lọc, sấy để thu đƣợc 5,06 g pectin thô.
Pectin thô đƣợc tách loại protein bằng phƣơng pháp Sevag sau đó đƣợc tách loại chất màu đƣợc tách loại bằng các chất hấp phụ nhƣ than hoạt tính rồi tiếp tục đƣợc tinh chế qua màng thẩm tách thu đƣợc 3,24 g pectin tinh chế.
Hình 2.7. Phễu chiết tách loại protein bằng dung dịch Sevag
Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của pectin
Phƣơng pháp thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do: Đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Vissotto và cộng sự (2013) [48]: 0,5 ml dung dịch mẫu ở các nồng độ khác nhau đƣợc trộn đều với 1,5 ml dung dịch 2mM FeSO4 , tiếp theo là 1,5 ml dung dịch H2O2 6mM, và 1,5ml dung dịch natri salicylat nồng độ 6mM. Hỗn hợp đƣợc ngâm trong bể điều nhiệt ở 37oC trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở bƣớc sóng 510 nm sau khi làm nguội hỗn hợp về nhiệt độ phòng. Ascorbid Acid (Vitamin C) đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
Nghiên cứu thành phần đường
Mẫu TDP đƣợc thủy phân trong dung dịch trifluoroacetic acid 1 mol/l trong 10 h ở 100oC trong ống nghiệm thủy tinh có nắp. Phần acid dƣ sau phản ứng đƣợc loại bỏ bằng cách sử dụng dòng khí N2 thổi vào ống trong điều kiện bể điều nhiệt ở 60oC. Thêm metanol vào ống nghiệm và đuổi dung môi đến khô (3 lần) sau đó thêm 1 ml nƣớc cất hai lần vào ống nghiệm để hòa tan phần chất rắn thu đƣợc.
2.5.2. Quy trình tổng hợp và tinh chế dẫn xuất pectin Sulfat hóa
Dẫn xuất Pectin Sulfat hóa đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp sunfat hóa pectin. Hỗn hợp tỷ lệ 3:1 của axit sulfuric đặc và butanol đƣợc chuẩn bị trong bể nƣớc đá. Tiếp theo, ammoni Sulfat đƣợc thêm vào và khuấy trong 10 phút.
Hình 2.8. Bộ thiết bị tổng hợp dẫn xuất pectin Sulfat hóa
Thêm từ từ 500 mg pectin vào hỗn hợp và khuấy đều trong các điều kiện về thời gian phản ứng khác nhau (là 30 phút và 90 phút) ở -6oC, sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH và kết tủa với etanol 95%. Kết tủa đƣợc rửa và hòa tan lại trong nƣớc, rồi thẩm tách dƣới dòng nƣớc chảy trong 48h. Sau quá trình phản ứng, thu đƣợc hai mẫu dẫn xuất Sulfat hóa là TDP-S1 và TDP S2.
Hình 2.9. Dung dịch đƣợc kết tủa với Etanol 95% 2.5.3. Quy trình tổng hợp và tinh chế dẫn xuất Selen hóa
Tiến hành tổng hợp dẫn xuất Selen hóa đƣợc thực hiện theo Wang và các cộng sự [50] với một chút thay đổi nhƣ sau: Pectin (300, 500 và 700mg) đƣợc phân tántrong 50ml dung dịch HNO30,7% ở nhiệt độ phòng trên máy khuấy từ trong 10 giờ. H2SeO3 (1,0g, 0,0077 mol) và BaCl2 (1,65g, 0,0079 mol) đã đƣợc thêm vào và khuấy trong 6 giờ khi nhiệt độ đạt đến 70oC. Sau phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm lạnh đến nhiệt độ phòng và giá trị pH đƣợc điều chỉnh đến 7-8 với dung dịch NaOH 1M. Na2SO4 đã đƣợc thêm vào để loại bỏ các Ba2+.
Hình 2.11. Dẫn xuất pectin Selen hóa kết tủa với etanol
Các hỗn hợp đã đƣợc kết tủa với EtOH (95%), rửa sạch, hòa tan trong nƣớc, và sau đó sử dụng màng thẩm tách MWCO 14000đối với nƣớc 48 giờ và nƣớc cất trong 24h cho đến khi dung dịch không màu khi Vc (ascorbic acid) đƣợc thêm vào. Sau khi Selen hóa, chúng tôi thu đƣợc ba mẫu dẫn xuất Selen hóa là TDP – Se1, TDP – Se2 và TDP – Se3.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PECTIN
3.1.1. Thành phần của pectin
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của cây cúc quỳ
Độ ẩm (%) 3,74 0,22 Tro (%) 4,98 0,88 Protein (%) 3,32 0,15 Chất béo (%) 1,77 0,32 Đƣờng (% w/w) 85,78 2,15 Bảng 3.2. Thành phần mono saccharide (%) Mannose 3,11 0,15 Glucorunic acid 1,15 0,71 Xylose 3,08 0,37 Galacturonic acid 47,59 0,59 Rhamnose 23,94 0,91 Galactose 3,04 0,11 Glucose 3,29 0,16 Arabinose 11,14 0,91 Fucose 0,57 0,08
Thành phần hóa học của mẫu phân lập từ cây cúc quỳ (TDP) đƣợc thể hiện trong bảng 3.1. Tổng hàm lƣợng đƣờng trong mẫu phân lập đƣợc từ cây cúc quỳ là 85,78%, kết luận rằng cacbohydrat là thành phần chính trong TDP.
Sắc kí đồ HPLC của dung dịch thủy phân TDP đƣợc trình bày trên hình 3.1 Các pic trên sắc kí đồ đƣợc xác định thông qua việc so sánh với thời gian lƣu của monosaccharide chuẩn đã đƣợc xây dựng từ trƣớc. Thành phần monosaccharide của TDP phân lập từ cây cúc quỳ đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Kết quả phân tích này tƣơng đồng với một số tác giả chỉ ra rằng monosaccharide chính trong polysaccharides từ thành tế bào là axit galacturonic, tiếp theo là rhamnose [14], [25]. Hàm lƣợng lớn axit galacturonic và rhamnose cho thấy sự có mặt của homogalacturonan và rhamnogalacturonan trong TDP. Sự có mặt đáng kể của arabinose chỉ ra sự tồn tại của các chuỗi arabinan trên mạch nhánh. Ngoài ra, một lƣợng đáng kể arabinose có thể chứng minh sự tồn tại của arabinan phân nhánh cao trong mạch của TDP. Kết quả này cho phép khẳng định TDP phân lập từ cây cúc quỳ có thành phần cấu trúc của pectin.
Hình 3.1. Sắc kí đồ HPLC của dịch thủy phân mẫu TDP 3.1.2. Phổ hồng ngoại của TDP
Phổ hồng ngoại của TDP phân lập từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.2. Đối với pectin, vùng dao động trong khoảng 1200-1800 cm-1
trên phổ IR đƣợc xem là vùng “vân tay” của mẫu. Tại đây, ta có thể quan sát trạng thái đặc trƣng của các nhóm carboxylic (khoảng 1750-1350 cm-1) [33]. Dải dao động ở vùng 1733 cm- 1
đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm C=O của gốc carboxylic acid không đƣợc ion hóa (tồn tại dƣới dạng methyl hóa hay gốc acid). Sự ion hóa gốc này (tạo thành muối) dẫn đến việc suy giảm tín hiệu này trên phổ và làm xuất hiện tín hiệu dao động hóa trị của COO-
tƣơng ứng trong vùng 1600-1650 (bất đối xứng) và 1400-1450cm-1 (đối xứng) [33].
Hình 3.2. Phổ hồng ngoại của pectin từ cây cúc quỳ
Mức độ ester hóa (DE) đƣợc định nghĩa là tỷ số giữa số lƣợng nhóm ester so với tổng số nhóm acid và nhóm ester và đƣợc đánh giá trực quan thông qua cƣờng độ tín hiệu của dải 1733 cm-1
. Hình 3.2 cho thấy pectin thu đƣợc từ cây cúc quỳ là loại pectin có mức độ este hóa (mức độ methyl hóa) thấp.
3.1.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR và 13C NMR của TDP
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của mẫu TDP thu đƣợc từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của mẫu pectin thu đƣợc từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 2 có rất nhiều điểm tƣơng đồng với phổ 1H- NMR của polysaccharide giàu arabinan phân lập từ Opuntia ficus-indica [53]. Vùng các tín hiệu anome trên phổ cho thấy các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 5,18, 5,03 và 5,01 đƣợc gán tƣơng ứng cho α-(1→5) arabinofuranosyl, α-(1→2) rhamnopyranosyl, và α- (1→4)-galactopyranosylacid. Sự có mặt của proton H6 của các đơn vị rhamnose thể hiện qua các tín hiệu cộng hƣởng ở độ dịch chuyển 1,12 và 1,23. Tín hiệu ở 1,12 ppm tƣơng ứng với gốc rhamnose liên kết (1 →2) với một galacturonic acid còn tín hiệu ở 1,23 ppm là của gốc rhamnose liên kết (2 →1) với một galacturonic acid và tạo nhánh ở O-4. Tín hiệu có cƣờng độ cao ở 3,70 ppm là tín hiệu của nhóm methyl liên kết với gốc GalA. Kết quả thu đƣợc hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin
chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA). Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin trong khi các đƣờng khác nhƣ arabinose (Ara), galactose (Gal), và xylose (Xyl) nằm trên các mạch nhánh [53].
Hình 3.4. Phổ13C NMR của TDP từ cây cúc quỳ
Trên hình 3.4, phổ 13C NMR của pectin cho thấy các tín hiệu anome đặc trƣng của rhamnose và glacturonic acid trong các khối cấu tạo của mạch chính rhamnogalacturonan ở 100,1 và 98,6 ppm đƣợc gán tƣơng ứng cho C1 của các đơn vị (1→2)- rhamnose và (1 →4)-galacturonic acid. Các tín hiệu ở 175,9 và 175,2 ppm đặc trƣng cho các nhóm chức carboxylic C6 tƣơng ứng của các đơn vị (1 →4)- galacturonicacid và galacturonicacid(1→2)-rhamnose. Trong khi đó, tín hiệu ở 17,2 ppm đặc trƣng cho các nhóm methyl của các đơn vị rhamnose. Bên cạnh đó, phổ 13C NMR của pectin còn thể hiện những tín hiệu đặc trƣng của các đơn vị (1 →5) arabinose qua các cộng hƣởng có độ dịch chuyển hóa học 108,5, 83,4, 78,3,84,9 và 67,6 ppm tƣơng ứng với C-1 − C-5.
Kết quả thu đƣợc cho thấy pectin từ cúc quỳ là loại pectin giàu arabinan với các dữ liệu phổ phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã xác định rằng thành phần cấu trúc của pectin chủ yếu chứa các đơn vị galacturonic acid (GalA). Rhamnose (Rha) là thành phần nhỏ trong mạch chính của pectin và arabinose (Ara) là thành phần đƣờng có hàm lƣợng đáng kể ở mạch nhánh [19], [53].
Sắc kí đồ thẩm thấu gel của mẫu pectin đƣợc trình bày trên hình 3.5.
Kết quả GPC của mẫu pectin cho phép xác định các thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lƣợng phân tử trung bình Mw = 1,39 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình số Mn = 1,15 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình Mz = 1,74 x 104 g/mol và đặc trƣngvề chỉ số phân tán PDI = MW/Mn = 1,2. Điều này cho thấy độ phân tán khối lƣợng của pectin từ cúc quỳ có tƣơng đối nhỏ.
.
Hình 3.5. Sắc kí đồ thẩm thấu gel - GPC của mẫu TDP từ cây cúc quỳ 3.1.5. Hoạt tính chống oxi hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.6.
Khi nồng độ pectin tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin tăng dần và đạt đến 88% khi nồng độ pectin đạt 10 mg/ml. Giá trị IC50 tƣơng ứng của pectin và vitamin C lần lƣợt là 4,73 mg/ml và 1,30 mg/ml. Kết quả này cho thấy có thể xem pectin là một nguồn chất chống oxi hóa từ tự nhiên đầy hứa hẹn.
Hình 3.6. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của TDP từ cúc quỳ 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SULFAT HÓA TỪ PECTIN
3.2.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Sulfat hóa
Khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng (Mw), khối lƣợng phân tử trung bình số(Mn), khối lƣợng phân tử trung bình z (Mz) và đặc trƣng về chỉ số phân tán PDI = MW/Mn của các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khối lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Sulfat hóa và hàm lƣợng Sulfat
Mẫu Hàm lƣợng DS Mw x 104 Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
Pectin 0 1,39 1,15 1,74 1,21
Pectin Sulfat hóa 1 (TDP-S1)
15,20 2,45 1,90 3,23 1,28
Pectin Sulfat hóa 2 (TDP-S2)
18,31 1,45 1,69 1,26 1,15
Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Sulfat hóa có giá trị DS và trọng lƣợng phân tử khác nhau thu đƣợc bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng.
Giá trị Mw của các mẫu Sulfat hóa cũng tăng nhẹ so với pectin ban đầu. Điều này có thể là do các gốc hydroxyl trong phân tử pectin đã đƣợc thay thế bằng
0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 12 H o ạt tính q u é t gố c h yd ro xy l t ự d o (% ) Nồng độ (mg/ml) Pectin Vitamin C
các gốc Sulfat. Tuy nhiên so với mẫu TDP-S1 (thời gian phản ứng 30 phút), mẫu TDP-S2 (thời gian phản ứng 90 phút) có các giá trị Mw, Mn, Mz và Mw/Mn giảm đi nhƣng hàm lƣợng DS tăng lên, điều này có thể giải thích là khi thời gian phản ứng Sulfat hóa tăng, một mặt giúp tăng hàm lƣợng Sulfat trong dẫn xuất nhƣng mặt khác lại thủy phân một phần phân tử.
Hình 3.7. Phổ FT-IR của mẫu TDP (trên) và TDP-S (dƣới)
Phổ IR của TDP và TDP-S đƣợc trình bày trên Hình 3.7. So sánh hai phổ này, chúng tôi thấy rằng, phổ của TDP-S thể hiện sự xuất hiện mới của tín hiệu hấp thụ tại vùng 800-880cm-1 đặc trƣng cho nhóm Sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự
giảm cƣờng độ hấp thụ của tín hiệu tại ~3261-3370cm-1 là đặc trƣng cho dao động của nhóm OH.
So sánh phổ 13C-NMR của TDP và TDP-S (Hình 3.8), ta thấy trên phổ 13C- NMR của TDP-S xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ chuyển dịch hóa học ở δ=77,2 ppm, đƣợc gán cho carbon ở vị trí C-2 của rhamnose, có sự dịch về phía trƣờng thấp hơn so với tín hiệu C-2 của vị trí carbon không thế, điều đó chứng tỏ mẫu TDP-S bị Sulfate hóa tại vị trí C-2 của rhamnose.
Hình 3.8. Phổ 13 C-NMR của các mẫu TDP (trên) so với TDP-S (dƣới)
Nhƣ vậy, các phân tích cấu trúc trên đây cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã đƣợc thực hiện.
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ và dẫn xuất Sulfat hóa đƣợc trình bày trên hình 3.9.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – 5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-S tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP- S1 là cao nhất so với pectin và TDP-S2. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 lần lƣợt là 55,3, và 47,8% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá trình Sulfat hóa giúp tăng cƣờng hoạt tính chống oxy hóa của pectin.
Hình 3.9. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Sulfat hóa
3.2.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thƣ của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa Sulfat hóa
Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 và TDP đƣợc khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào MKN7. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trên bảng 3.4.
0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 S c a v e n g ing e ff e c t( %) Concentration (mg/mL) TDP TDP-S1 TDP-S2 Vitamin C
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ MKN7 của các mẫu TDP và TDP-S Nồng độ (µg/ml) TDP-S1 TDP-S2 TDP Nồng độ (µg/ml) Ellipticine 400 49,02 46,35 45,96 10 96,47 200 22,07 28,31 22,13 2 90,28 100 10,12 17,74 10,79 0,4 55,11 50 -2,25 8,32 3,7 0,08 19,79 IC50 >100 >100 >100 IC50 0.35 ± 0.03
Kết quả cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin có tác dụng tăng hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thƣ MKN7 không đáng kể so