6. Bố cục luận văn
3.1.4. Sắc kí thẩm thấu gel GPC
Sắc kí đồ thẩm thấu gel của mẫu pectin đƣợc trình bày trên hình 3.5.
Kết quả GPC của mẫu pectin cho phép xác định các thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lƣợng phân tử trung bình Mw = 1,39 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình số Mn = 1,15 x 104 g/mol, khối lƣợng phân tử trung bình Mz = 1,74 x 104 g/mol và đặc trƣngvề chỉ số phân tán PDI = MW/Mn = 1,2. Điều này cho thấy độ phân tán khối lƣợng của pectin từ cúc quỳ có tƣơng đối nhỏ.
.
Hình 3.5. Sắc kí đồ thẩm thấu gel - GPC của mẫu TDP từ cây cúc quỳ 3.1.5. Hoạt tính chống oxi hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ đƣợc trình bày trên hình 3.6.
Khi nồng độ pectin tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin tăng dần và đạt đến 88% khi nồng độ pectin đạt 10 mg/ml. Giá trị IC50 tƣơng ứng của pectin và vitamin C lần lƣợt là 4,73 mg/ml và 1,30 mg/ml. Kết quả này cho thấy có thể xem pectin là một nguồn chất chống oxi hóa từ tự nhiên đầy hứa hẹn.
Hình 3.6. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của TDP từ cúc quỳ 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SULFAT HÓA TỪ PECTIN
3.2.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Sulfat hóa
Khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng (Mw), khối lƣợng phân tử trung bình số(Mn), khối lƣợng phân tử trung bình z (Mz) và đặc trƣng về chỉ số phân tán PDI = MW/Mn của các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khối lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Sulfat hóa và hàm lƣợng Sulfat
Mẫu Hàm lƣợng DS Mw x 104 Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
Pectin 0 1,39 1,15 1,74 1,21
Pectin Sulfat hóa 1 (TDP-S1)
15,20 2,45 1,90 3,23 1,28
Pectin Sulfat hóa 2 (TDP-S2)
18,31 1,45 1,69 1,26 1,15
Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Sulfat hóa có giá trị DS và trọng lƣợng phân tử khác nhau thu đƣợc bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng.
Giá trị Mw của các mẫu Sulfat hóa cũng tăng nhẹ so với pectin ban đầu. Điều này có thể là do các gốc hydroxyl trong phân tử pectin đã đƣợc thay thế bằng
0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 12 H o ạt tính q u é t gố c h yd ro xy l t ự d o (% ) Nồng độ (mg/ml) Pectin Vitamin C
các gốc Sulfat. Tuy nhiên so với mẫu TDP-S1 (thời gian phản ứng 30 phút), mẫu TDP-S2 (thời gian phản ứng 90 phút) có các giá trị Mw, Mn, Mz và Mw/Mn giảm đi nhƣng hàm lƣợng DS tăng lên, điều này có thể giải thích là khi thời gian phản ứng Sulfat hóa tăng, một mặt giúp tăng hàm lƣợng Sulfat trong dẫn xuất nhƣng mặt khác lại thủy phân một phần phân tử.
Hình 3.7. Phổ FT-IR của mẫu TDP (trên) và TDP-S (dƣới)
Phổ IR của TDP và TDP-S đƣợc trình bày trên Hình 3.7. So sánh hai phổ này, chúng tôi thấy rằng, phổ của TDP-S thể hiện sự xuất hiện mới của tín hiệu hấp thụ tại vùng 800-880cm-1 đặc trƣng cho nhóm Sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự
giảm cƣờng độ hấp thụ của tín hiệu tại ~3261-3370cm-1 là đặc trƣng cho dao động của nhóm OH.
So sánh phổ 13C-NMR của TDP và TDP-S (Hình 3.8), ta thấy trên phổ 13C- NMR của TDP-S xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ chuyển dịch hóa học ở δ=77,2 ppm, đƣợc gán cho carbon ở vị trí C-2 của rhamnose, có sự dịch về phía trƣờng thấp hơn so với tín hiệu C-2 của vị trí carbon không thế, điều đó chứng tỏ mẫu TDP-S bị Sulfate hóa tại vị trí C-2 của rhamnose.
Hình 3.8. Phổ 13 C-NMR của các mẫu TDP (trên) so với TDP-S (dƣới)
Nhƣ vậy, các phân tích cấu trúc trên đây cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã đƣợc thực hiện.
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ và dẫn xuất Sulfat hóa đƣợc trình bày trên hình 3.9.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – 5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-S tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP- S1 là cao nhất so với pectin và TDP-S2. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 lần lƣợt là 55,3, và 47,8% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá trình Sulfat hóa giúp tăng cƣờng hoạt tính chống oxy hóa của pectin.
Hình 3.9. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Sulfat hóa
3.2.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thƣ của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa Sulfat hóa
Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các mẫu TDP-S1, TDP-S2 và TDP đƣợc khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào MKN7. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trên bảng 3.4.
0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 S c a v e n g ing e ff e c t( %) Concentration (mg/mL) TDP TDP-S1 TDP-S2 Vitamin C
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ MKN7 của các mẫu TDP và TDP-S Nồng độ (µg/ml) TDP-S1 TDP-S2 TDP Nồng độ (µg/ml) Ellipticine 400 49,02 46,35 45,96 10 96,47 200 22,07 28,31 22,13 2 90,28 100 10,12 17,74 10,79 0,4 55,11 50 -2,25 8,32 3,7 0,08 19,79 IC50 >100 >100 >100 IC50 0.35 ± 0.03
Kết quả cho thấy quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của pectin có tác dụng tăng hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thƣ MKN7 không đáng kể so với polysaccharide ban đầu. Điều này đặt ra yêu cầu cần tìm con đƣờng tạo dẫn xuất để nâng cao hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hiệu quả hơn. Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tiếp tục triển khai quá trình tạo dẫn xuất Selen hóa pectin.
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC DẪN XUẤT SELEN HÓA TỪ PECTIN 3.3.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Selen hóa 3.3.1. Cấu trúc của dẫn xuất pectin Selen hóa
Khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng (Mw), khối lƣợng phân tử trung bình số(Mn), khối lƣợng phân tử trung bình z(Mz), độ phân tán (PDI, Mw / Mn) cho tất cả các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 3.5. Kết quả cho thấy các dẫn xuất pectin Selen hóa có hàm lƣợng Se và trọng lƣợng phân tử khác nhau thu đƣợc bằng cách thay đổi các điều kiện phản ứng. Kết quả cho thấy các mẫu dẫn xuất có độ phân tán tăng nhẹ so với pectin không đƣợc Selen hóa.
Bảng 3.5. Khối lƣợng phân tử của pectin và các dẫn suất Selen hóa
Mẫu Hàm lƣợng
Se (μg/g) Mw x 10
4
Mn x 104 Mz x 104 Mw/Mn
Pectin 0 1,39 1,15 1,74 1,21
Pectin Selen hóa 1 1887 2,47 1,90 3,23 1,30
Pectin Selen hóa 2 1695 2,45 1,92 3,20 1,28
Giá trị Mw tăng có thể là do các -OH mà đã đƣợc thay thế bởi [28]. Vì vậy, có thể giả định rằng Mw của các mẫu pectin Selen hóa cao hơn có thể là do sự hiện diện của các nhóm chức chứa Selen mới thêm vào thay thế nhóm hydroxyl trong pectin.
Hình 3.10. Phổ FT-IR của TDP (trên) và dẫn xuất pectin Selen hóa TDP-Se (dƣới)
Phổ FT-IR của pectin và dẫn xuất pectin Selen hóa khá tƣơng đồng đƣợc minh họa trong Hình 3.11. Đỉnh khoảng 3400 và 2930 cm-1 trong TDP và Se-TDP tƣơng ứng sự hấp thụ C-H và dao động kéo dài O-H. Các dao động thuộc vùng từ 2200 đến 950 cm-1, đƣợc coi là "dấu vân tay" của cacbohydrat, đặc trƣng cho từng
loại polysaccharide [26]. Các dải 1722 và 1651 cm-1 đƣợc quy kết tƣơng ứng với nhóm cacbonyl (C = O) dao động hóa trị của các nhóm methyl este hóa và không este hóa và carboxyl pectin. Đặc biệt, so sánh phổ hồng ngoại của pectin và pectin Selen hóa cho thấy, trên phổ của dẫn xuất Selen hóa xuất hiện thêm một dải hấp thụ ở 640 cm-1, trong khi đó vạch hấp thụ này không xuất hiện trong phổ của TDP. Theo nghiên cứu trƣớc đây [41], dải đặc trƣng giữa 600 - 700 cm-1 biểu hiện dao động kéo dài Se-O-C bất đối xứng. Điều này chứng tỏ rằng dẫn xuất pectin Selen hóa đã đƣợc tổng hợp thành công theo quy trình. Qua so sánh Phổ 13
C NMR của mẫu TPD-Se hoàn toàn giống phổ 13C NMR của mẫu TDP-S, nên chúng tôi tiến hành khảo sát thêm phổ khối lƣợng của mẫu TDP-Se so với mẫu TDP.
Nhƣ đã biết, phổ khối lƣợng ESI-MS là một trong những công cụ nghiên cứu cấu trúc hữu hiệu đối với các hợp chất hữu cơ nói chung và các polysaccharide nói riêng. Con đƣờng phân mảnh chính để tạo nên các ion trong quá trình ion hóa các phân tử polysaccharide dựa trên sự phân ly của liên kết C-O giữa các đơn vị saccharide của chuỗi phân tử [24]. Trong phổ MS của TDP (Hình 3.11), đỉnh cơ bản (đỉnh có cƣờng độ cao nhất) tại m/z 177 và đỉnh tại m/z 189 chỉ ra rằng axit galacturonic là thành phần chính trong phân tử TDP. Thêm vào đó, đỉnh 358 chỉ ra sự tồn tại của các đơn vị rhamnose galacturonic liên kết trong phân tử.Trong phổ này, đỉnh tại m/z 475 có cƣờng độ thấp đƣợc gán cho phân mảnh [(GalA - OH + Na) RhaAra] + cho thấy sự thay thế của arabinose ở các chuỗi bên trái của xƣơng sống rhamnogalacturonan. Tuy nhiên, trong phổ MS của TDP-Se (Hình 3.12), đỉnh m/z 475 này có cƣờng độ cao nhất là do sự góp mặt đáng kể của ion mới [(GalA-O) (NaSeO3) Rha + H+]. Bên cạnh đó, trên phổ Se-TDP còn xuất hiện một số ion mới trong nhƣ 521, 645, điều này không chỉ chứng minh sự thành công của quá trình Selenyl hóa mà còn khẳng định mối liên kết homogalacturan và rhamnogalacturonan của TDP (Bảng 3.6.). Nói tóm lại, các kết quả trên đã chứng minh rằng các nhóm Selenyl đã đƣợc thay thế thành công trên TDP trong quá trình Selenyl hóa.
Hình 3.11. Phổ ESI-MS của mẫu TDP
Bảng 3.6. Các phân mảnh chính trên phổ khối ESI-MS của các mẫu pectin và pectin Selen hóa
m/z Phân mảnh TDP TDP- Se1 TDP- Se2 TDP- Se3 177 [GalA – OH]+ x x x x
189 [GalA –CO + Na]+ x x x x
340 [GalARha ]+ x x x
358 [GalARha + H2O]+ x x x x
475 [(GalA – O –H+ +Na+)RhaAra ]+ x x x x [{(GalA–O )(NaSeO3)} Rha +H+ ]+ x x x 521 [GalA{(GalA–OH) (NaSeO3)} + H2O]+ x x x
534 [GalAGalARha + H2O]+ x x x x
645 [GalA{(GalA-OH)(NaSeO3)}Rha – Na+ + H3O]+
x x x
3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin và dẫn xuất Selen hóa
Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin từ cúc quỳ và các dẫn xuất Selen hóa đƣợc trình bày trên hình 3.14.
Từ đồ thị cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – 5 mg/mL, khi nồng độ pectin TDP và dẫn xuất TDP-Se tăng, khả năng quét gốc tự do của pectin và các dẫn xuất tăng dần. Hoạt tính của dẫn quét gốc hydroxyl của mẫu TDP-Se1 là cao nhất so với pectin va các dẫn xuất. Tại nồng độ nghiên cứu 5 mg/mL, khả năng quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu TDP-Se1, TDP-Se2, TDP- Se3 lần lƣợt là 65,7, 59,5 và 55,3% trong khi đó khả năng quét gốc tự do của pectin ở nồng độ này chỉ đạt 42,8%. Kết quả cho thấy rằng quá trình Selen hóa giúp tăng cƣờng rõ rệt hoạt tính chống oxy hóa của pectin.
Hình 3.14. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Selen hóa
3.3.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thƣ của pectin và dẫn xuất Selen hóa Selen hóa
Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các mẫu TDP-Se và TDP đƣợc khảo sát bằng các thử nghiệm SBR trên các dòng tế bào MKN7. Kết quả đƣợc trình bày trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ MKN7 của các mẫu TDP và TDP-Se Nồng độ (µg/ml) TDP- Se1 TDP- Se2 TDP- Se3 TDP Nồng độ (µg/ml) Ellipticine 200 89,94 80,96 77,65 22,13 10 96,47 100 64,98 61,95 59,67 10,79 2 90,28 50 51,15 47,85 43,76 3,7 0,4 55,11 20 21,12 20,09 18,87 -2,5 0,08 19,79 IC50 72,93 ± 0,07 83,59 ± 0,10 92,58 ± 0,05 >100 IC50 0,35 ± 0,03 0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 S ca ve n g ing e fe ct ( %) Concentration (mg/ml) TDP TDP-Se1 TDP-Se2 TDP-Se3 Vitamin C
Kết quả cho thấy chỉ ra rằng TPD-Se có thể ức chế sự gia tăng tế bào ung thƣ dạ dày ngƣời MKN7, tỷ lệ ức chế của Se-TDP tăng đáng kể khi tăng liều và tỷ lệ ức chế của Se-TDP cao hơn hẳn so với TDP. Ngoài ra, TDP với liều thấp có thể tạm thời gây ra sự tăng sinh tế bào. Giá trị IC50 của TDP-Se1 (72.93 μg/mL), TDP-Se2 (83.59 μg/mL), TDP-Se3 (92.58 μg/mL) thu đƣợc từ tỷ lệ ức chế. Điều này cũng gợi ý rằng Seleno-polysaccharide thu đƣợc từ Selenyl hóa có thể tăng lên đáng kể độc tế bào đối với tế bào khối u, hứa hẹn là một trong những giải pháp tạo dẫn xuất có hoạt tính chống ung thƣ.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Pectin phân lập từ cúc quỳ thuộc loại pectin có mức độ este hóa thấp có khối lƣợng phân tử trung bình là 1.39 x 104
g/mol.
Cấu trúc của pectin đƣợc tạo nên từ các các đơn vị (1→2)- rhamnose và (1 →4)-galacturonic acid tạo nên mạch chính. Mạch nhánh của pectin thuộc loại mạch giàu arabinan đƣợc tạo nên từ các đơn vị (1 →5) arabinose.
Pectin từ cúc quỳ có khả năng quét gốc hydroxyl tự do với giá trị IC50 là 4,73 mg/ml, hứa hẹn có thể sử dụng là nguồn chất chống oxi hóa dồi dào từ thiên nhiên.
Dẫn xuất Sulfat hóa của pectin đã đƣợc tổng hợp thành công và đƣợc xác định cấu trúc bằng GPC, FT-IR và 13C-NMR. Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và gây độc tế bào ung thƣ MKN7 của pectin và dẫn xuất Sulfat hóa cho thấy quá trình Sulfat hóa giúp tăng cƣờng hoạt tính chống oxi hóa nhƣng không làm thay đổi rõ nét hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ MKN7 so với pectin ban đầu.
Cấu trúc và khả năng gây độc tế bào ung thƣ của pectin Selen hóa đƣợc nghiên cứu so sánh với pectin. Kết quả nghiên cứ hoạt tính cho thấy các nhóm Selen đƣợc thêm phân tử pectin có thể làm tăng hoạt tính chống oxi hóa và cả hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ trên dòng MKN7. Kết quả này hứa hẹn quá trình Selenyl hóa là giải pháp hiệu quả nâng cao hoạt tính chống ung thƣ của pectin.
Kiến nghị
Do thời gian và kinh phí nghiên cứu có hạn, thông qua kết quả của đề tài tiếp tục nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình phân lập pectin, qui trình bán tổng hợp dẫn suất Selen hóa và Sulfat hóa để nâng cao hiệu suất và tiến hành trên quy mô lớn.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ.
[2] Nguyễn Ngọc Hƣng, Trần Thị Vân Thi (2014), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Huế, tập 2, số 1.
[3] Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Bilan M.I. và Usov A.I. (2012), Nghiên cứu cấu trúc của Fucoidan tách chiết từ tảo nâu
Sargassum Polycystumn, Tạp chí hóa học, T. 50 (4A), tr. 215 – 218
[4] Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cƣờng, Trần Văn Sung (2007 h n ậ đ c đ củ c n từ n ơ n n , Tạp chí Hóa học, số 3, tập 45, tr. 339-345.
[5] Trần Minh Trang, Phạm Tiến Dũng, Lê Quốc Phong, Đinh Minh Hiệp (2016),
Nghiên cứu khả năn hấp thu Selenium của nấm Ophiocordyceps sinensis trong nuôi cấy lỏng, Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 19, Số T6, 53-60.
Tiếng Anh
[6] A.F. Martinez, L. Charlet (2009), Reviews in Environmental Science and
Biotechnology 8, 81–110.
[7] AOAC International (1996), Official Methods of Analysis of the Association of
Official Analytical Chemists,16th edition, Gaithersburg, USA,136.
[8] B. Frei, M. Baltisberger, O. Sticher, M. Heinrich (1998), Medical ethnobotany of the Zapotecs of the Isthmus-Sierra (Oaxaca, Mexico), documentation and assessment of indigenous uses, J. Ethnopharmacol, 62, 149.
[9] Bo Yuan, Xu-qin Yang, Meng Kou, Chang-yan Lu, Yuan-yuan Wang, Jun Peng, Ping Chen, and Ji-hong Jiang (2017), Selenylation of Polysaccharide from the Sweet Potato and Evaluation of Antioxidant, Antitumor, and Antidiabetic Activities, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (3), 605-617.
[10] D.J. Shang, J.N. Zhang, L. Wen, Y. Li, Q. Cui (2009), Journal of Agricultural