6. Bố cục uận văn
1.3.2. Tron gY học
Trong y học cổ truyền dân tộc, có sử dụng chùm ruột làm vị thuốc chữa bệnh [34], [35]
- Chữa đau nhức (đau lƣng, chân, háng): Lá chùm ruột tư i giã nát cùng hồ tiêu đắp vào chỗ đau
- Chữa suy yếu tim: Vỏ thân chùm ruột 1 phần, vỏ thân vông đồng 2 phần. Sắc lên, cô lại thành cao đặc. hi ùng hòa vào rượu trắng, uống ngày 2 muỗng cafe, chia làm 2 lần.
- Chữa lở ngứa, mề đay, ghẻ loét, vết thƣơng ngoài da: Vỏ thân cây ph i khô tán ột chưng với dầu dừa ùng để bôi.
- Dƣỡng da bạn gái và phụ nữ: Ăn khoảng 200 gr quả chùm ruột mỗi ngày, nhất là khi trời nắng nóng.
- Các vị thuốc từ lá cây chùm ru t
Lá chùm ruột có tính nóng, có tác dụng làm tan ứ huyết tiêu độc, tiêu đờm sát trùng đặc biệt chống độc đối với nọc độc rắn.
Lá cây chùm ruột ùng để đun nước tắm chữa lở, nổi mề đay và các bệnh ngoài da khác.
Lá chùm ruột tư i giã nát cùng hồ tiêu rồi đắp vào chỗ đau chữa đau nhức.
- Các vị thuốc từ quả cây chùm ru t.
Quả chùm ruột có vị chua, tính mát, có tác dụng giải nhiệt, bổ gan, bổ máu.
- Các vị thuốc từ vỏ thân cây chùm ru t.
Vỏ thân cây có khả năng tiêu hạch độc, ung nhọt tiêu độc, sát trùng, trừ tích ở phế đặc biệt là chống độc đối với nọc rắn.
Rượu ngâm vỏ thân cây nhỏ vào tai chữa thối tai tiêu mủ, bôi chữa ghẻ, loét, vết thư ng chảy máu ngoài da, ngậm chữa đau răng đau họng. Ngoài ra, bột vỏ thân ngâm dấm còn chữa được bệnh trĩ ngày uống 2 lần, mỗi lần 1 thìa canh.
Cách làm rượu vỏ chùm ruột như sau: Ph i khô vỏ thân cây, tán thành
bột mịn. Rượu trắng nồng độ cao, cứ 200g bột ngâm với 1 ít rượu để trong 10 ngày là sử dụng được.
- Các vị thuốc từ rễ cây chùm ru t.
Rễ cây chùm ruột c tính n ng độc, có tác dụng làm tan ứ huyết, tiêu độc tiêu đờm sát trùng đặc biệt chống độc đối với nọc độc rắn. Rễ và hạt có tác dụng tẩy.
Rễ và vỏ rễ c độc, vì thế cần đun sôi vỏ rễ, xông hít chữa ho và nhức đầu.
ruột chữa bệnh vảy nến.
Lƣu ý: cấm không được uống nước sắc cũng như rượu ngâm vỏ rễ cây chùm ruột vì rất độc. Có khả năng gây chết người, nhẹ th cũng váng vất, nhức đầu, nặng h n sẽ đau ụng dữ dội và xấu nhất có thể tử vong.
Theo Y học cổ truyền nước ngoài [36]
Xi-rô từ nước ép quả chùm ruột được sử dụng để trị bịnh dạ dày, và có tác dụng bổ gan.
Ở Ấn Độ dùng lá chùm ruột đâm nát đắp ngoài để điều trị đau thần kinh tọa đau ưng và thấp khớp. Lá nấu chín đắp lên mụn nhọt giúp hút mủ rất tốt. goài ra người ta còn nhai lá chùm ruột để xoa dịu các chứng viêm họng và miệng.
Theo nghiên cứu về thành phần hóa học trong dịch chiết của lá chùm ruột có chứa các chất có ứng dụng trong y học như: Vitamin E, Stigmasterol,
γ-Sitosterol, Campesterol, beta-Sitosterol .
Vitamin E ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của động vật, giúp bảo dảm chức năng nh thường của nhiều mô và c quan. àm tăng tác ụng của protein và vitamin A. Ngoài ra, vitamin E còn có tác dụng ngăn cản các acide éo chưa no khỏi bị oxy hóa.
Stigmasterol rất hữu ích trong việc ngăn ngừa một số bệnh ung thư ao gồm cả buồng trứng, tuyến tiền liệt. Stigmastero đã được chứng minh rằng có thể ức chế sự suy thoái viêm xư ng khớp do thoái hóa sụn và nó là chất chống oxy hóa mạnh. ß-Sitostero được dùng chữa bệnh tim và cholesterol cao. Chất này cũng được sử dụng để thúc đẩy hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa ung thư ruột kết cũng như sỏi mật, viêm khớp dạng thấp, bệnh ao ung thư cổ tử cung.
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu
Vỏ rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels) được thu lấy vào tháng 7 năm 2015, tại quận Liên Chiểu Đà ẵng.
Hình 2.1.a) Rễ cây chùm ruột. b) Vỏ rễ cây chùm ruột tươi
2.1.2. Xử lí nguyên liệu
Vỏ rễ chùm ruột sau khi được rửa sạch, để khô trong không khí sau đ nghiền nhỏ, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp nhựa có nắp.
Hình 2.3. Hộp nhựa đựng bột vỏ rễ chùm ruột sau khi nghiền nhỏ
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. h ết ị c
- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent (tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo ường chất ượng 2- Đà ẵng).
- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer (phòng thí nghiệm khoa Sinh- Môi trường trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng).
- Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách thủy, sinh hàn hồi ưu cốc thủy tinh đũa thủy tinh, bình tam giác, ống đong ếp điện, phễu lọc, phễu chiết, các loại pipet nh định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, bản mỏng, cột chạy sắc ký...
b. ch t
Bảng 2.1. Hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm
STT Tên hóa chất Đ tinh khiết Tiêu
chuẩn Nguồn gốc
1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
STT Tên hóa chất Đ tinh khiết Tiêu
chuẩn Nguồn gốc
6 Dung dịch H2SO4 Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc 7 Dung dịch HNO3 Đậm đặc (63%) TCCS Trung Quốc 8 Dung dịch CH3COOH Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc
9 Silicagel Tinh khiết TCCS Đức
10 Vanilin Thư ng mại TCCS Trung Quốc
2.1.4. Sơ đồ chiết tách bằng phƣơng pháp chiết soxhlet
Thu hái và xử lí
Chiết song song
Cô Cô Cô Cô
Hình 2.4. Sơ đồ chiết tách bằng phương pháp soxhlet
Cao chloroform Vỏ rễ chùm ruột Bột vỏ rễ Xác định chỉ tiêu hóa lý Độ ẩm àm ượng tro àm ượng kim loại Dịch chiết hexane Dịch chiết chloroform Dịch chiết ethanol Dịch chiết methanol Cao hexane Cao ethanol Cao methanol - Cân xác định khối ượng - Định danh bằng phổ GC/MS
2.1.5. Sơ đồ chiết tách, xác định thành phần hóa học của các phân đoạn từ tổng cao ethanol
chưng ninh
làm bay hơi
dung môi
phân tán vào nước Cô
chiết lỏng lỏng bằng hexane
chiết lỏng lỏng bằng ethyl acetate
Cô cạn Cô cạn phân lập phân đoạn
ình 2.5. Sơ đồ điều chế cao chiết
Vỏ rễ chùm ruột Dịch chiết ethanol Dịch chiết ethanol Cao tổng ethanol Huyền phù Huyền phù Dịch hexane
Cao hexane Huyền phù
còn lại Dịch ethyl acetate Cao ethyl acetate - Đo GC/MS. Chạy sắc kí cột , sắc kí bản mỏng Đo GC/MS Thử hoạt tính sinh học
2.2. XÁC ĐỊNH CÁC TH NG SỐ HÓA LÝ CỦA VỎ RỄ CHÙM RUỘT 2.2.1. Xác định đ ẩm [10]
N t c
Dùng sức n ng àm ay h i hết h i nước trong mẫu. Cân trọng ượng mẫu trước và sau khi sấy khô từ đ tính ra phần trăm nước c trong mẫu.
ách t ế hà h
Chuẩn bị 3 chén sứ và đánh số thứ tự 1 đến 3, các cốc sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối ượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối ượng các chén sứ.
Xác định độ ẩm của bột vỏ rễ cây chùm ruột: cho vào mỗi cốc sứ m g bột và cân khối ượng cả chén và bột. Ghi lại giá trị khối ượng (m1). Sau đ tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 90oC, sau 3h lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội hẳn th đêm cân. Ghi ại giá trị khối ượng (m2).
c. Tính toán kết quả
- Độ ẩm mỗi mẫu: W(%) = 100% - Độ ẩm trung bình WTB(%) = 100%
Trong đ : m: Khối ượng mẫu bột (g).
m1: Khối ượng chén và mẫu bột trước khi sấy (g). m2: Khối ượng chén và mẫu bột sau khi sấy (g). W: Độ ẩm của mỗi mẫu (%).
WTB: Độ ẩm trung bình (%).
2.2.2. Xác định hàm lƣợng tro [11] a. Nguyê t c
Để xác định hàm ượng hữu c tổng và các nguyên tố vô c trong c thể động – thực vật người ta ùng phư ng pháp tro h a mẫu. Mẫu được xử s ộ sau đ đem nung ở nhiệt độ 450-500oC trong chén sứ chịu nhiệt. Các chất
hữu c ị đốt cháy trong tro còn ại các chất vô c kh ay h i. hối ượng chất hữu c tổng được tính à tổng chất hữu c ị đốt cháy và à hiệu số giữa khối ượng mẫu an đầu và khối ượng tro sau khi nung.
ách t ế hà h
Lấy cốc sứ sau khi đã xác định độ ẩm đem tro hoá trong ò nung ở nhiệt độ 600o
C. Sau thời gian 20h, ta thấy tro ở dạng bột mịn, màu trắng xám. Dùng kẹp sắt lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân. Ghi khối ượng (m3).
c. Tính toán kết quả
- àm ượng tro mỗi mẫu: H(%) = 100% - àm ượng tro trung bình: HTB(%) = 100% Trong đ : m: Khối ượng mẫu bột (g).
m0: Khối ượng chén sứ
m3: Khối ượng chén và mẫu bột sau khi tro hoá (g). : àm ượng tro trong bột vỏ rễ cây chùm ruột (%). HTB: àm ượng tro trung bình.
Hình 2.6. Mẫu bột vỏ rễ chùm ruột đã tro hóa
2.2.3. Xác định hàm lƣợng kim loại [1]
N t c
ách t ế hà h
Tro thu được sau khi nung đem hoà tan ằng dung dịch nước cường toan (3ml HCl và 1ml HNO3) định mức bằng nước cất đến 50ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm ượng một số kim loại nặng à Cu P s… bằng phư ng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà ẵng. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử với hiệu chỉnh nền Zeeman và Deuterium cho hoạt động với ngọn lửa và lò graphite gia nhiệt ngang của Analytik- Jena. Nhiệt độ nước làm mát tuần hoàn 3800C, tốc độ 3 ít/phút kích thước máy 260/660/560 mm.
c h ết ả
Công thức chuyển đổi hàm ượng mg/l sang mg/kg:
( / ) (mg/ l) 1000 mg kg C V n C
Trong đ : n: Khối ượng mẫu bột (g). V: Thể tich định mức (ml).
2.3. CHIẾT SOXLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ VỎ RỄ CHÙM RUỘT
2.3.1. Nguyên tắc
Chiết soxhlet là một kiểu chiết liên tục được thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết. Kiểu chiết này cũng như à kiểu chiết lỏng - lỏng nên về bản chất của quá trình chiết à tuân theo định luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Trong đ pha rắn nằm trong mẫu sẽ được hòa tan bởi pha lỏng gọi là dung môi.
2.3.2. Dụng cụ
2.3.3. Cách tiến hành
Chuẩn ị 4 túi vải cho 15g ột vỏ rễ chùm ruột vào mỗi túi sau đ tiến hành chiết soxhlet trong 200ml với các dung môi hexane, chloroform, methanol và ethanol bằng cách sử dụng nhiệt độ từ nồi cách thủy. ưu đặt vài viên i thủy tinh ưới đáy ống để tránh àm nghẹt ối ra vào của ống thông nhau. hông được để ượng ột vỏ rễ cây trong ống cao h n vượt h n mức cong của ống thông nhau.
Về c ản nhiệt độ bên ngoài từ nồi cách thủy điều chỉnh sao cho cao h n nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 5 - 10oC để quá trình chiết soxhlet cứ 30 - 45 phút dịch chiết được rút xuống 1 lần.
Chiết kiệt chất trong bột vỏ rễ chùm ruột trong 32 tiếng, kiểm tra đã chiết kiệt chưa bằng cách chấm một ít dịch trong hốc chiết lên miếng kính và để cho ung môi ay h i nếu trên miếng kính không có vết gì chứng tỏ đã chiết kiệt.
Đem ọc thu được các ịch chiết hexane, chloroform, methanol, ethanol. Sau đ ấy một phần ịch chiết đo phổ GC-MS tại Trung tâm ỹ thuật Tiêu chuẩn Đo ường Chất ượng II số 2- gô Quyền- Đà ẵng. Phần còn ại đem cô cạn thu được cao chiết của các ung môi đem cân ta được kết quả.
Hình 2.7. Hệ thống 4 bộ soxhlet dùng để chiết bột vỏ rễ chùm ruột với các dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, ethanol
2.3.4. Chƣơng trình chạy sắc ký GC-MS
Đo GC–MS xác định thành phần h a học c trong mỗi ịch chiết với chư ng tr nh chạy như sau:
- Cột sắc ký mao quản: HP-5: 30 m x 250 µm x 0.25 µm - Chư ng tr nh nhiệt độ lò cột
50 °C 0’) 120°C 165 °C 300 °C 10’) - Buồng tiêm mẫu
+ Nhiệt độ buồng tiêm mẫu : 280 °C + Áp suất : 7.6522 psi + Tỷ lệ chia dòng : 10 :1 + Thể tích tiêm : 1µl - Khối phổ + Khoảng phổ quét : 28 – 600 m/z + Nhiệt độ nguồn : 230oC
2.4. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT BỘT VỎ RỄ CHÙM RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHƢNG NINH
2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt đ đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
a. Ả h hưởng của thời gian: Tiến hành chưng ninh 6 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 700
C trong khoảng thời gian thay đổi
từ: 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đem ọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao
chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn thời gian chiết thích hợp là thời gian tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
b. Ả h hưởng của nhiệt độ sôi: Tiến hành chưng ninh 8 mẫu, mỗi mẫu tăng 7 °C/min tăng 1 °C/min tăng 30 °C/min
cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chưng ninh ở các nhiệt độ thay đổi từ: 45oC, 50oC, 60oC, 65oC,
70oC, 75oC, 80oC và 90oC, trong khoảng thời gian tốt nhất đã chọn là 8h. Đem
lọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn nhiệt độ chiết thích hợp là nhiệt độ tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ rắn - lỏng đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Chuẩn bị 6 mẫu cho lần ượt vào 6 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác trong khoảng 10gam sau đ cho ung môi ethano vào ở các thể tích thay đổi
40, 60, 80, 100, 120, 140ml. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C trong
khoảng thời gian thích hợp đã chọn là 8h.
Đem ọc đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết thu được cao chiết ở các nhiệt độ khác nhau. Đem cân ta được kết quả hàm ượng cao chiết.
2.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của số lần chiết đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Cân chính xác khoảng 30gam mẫu cho vào bình cầu 500m sau đ cho 300ml dung môi ethanol vào. Tiến hành chiết chưng ninh trong khoảng thời gian 8h với nhiệt độ là 800C.
Đem ọc thu được dịch chiết lần 1, còn bã sau khi lọc ta cho vào bình cầu, thêm vào 300ml dung môi ethanol tiếp tục đun trong thời gian và nhiệt độ trên.
Tư ng tự ta có dịch chiết lần 2, lần 3 và lần 4.
Cách tính hàm lƣợng cao chiết:
- Khối ượng cao chiết: m = m2 – m1
- Phần trăm cao chiết: X= 100% Trong đ :
m0: Khối ượng mẫu đem chiết.