6. Bố cục uận văn
2.3.3.Cách tiến hành
Chuẩn ị 4 túi vải cho 15g ột vỏ rễ chùm ruột vào mỗi túi sau đ tiến hành chiết soxhlet trong 200ml với các dung môi hexane, chloroform, methanol và ethanol bằng cách sử dụng nhiệt độ từ nồi cách thủy. ưu đặt vài viên i thủy tinh ưới đáy ống để tránh àm nghẹt ối ra vào của ống thông nhau. hông được để ượng ột vỏ rễ cây trong ống cao h n vượt h n mức cong của ống thông nhau.
Về c ản nhiệt độ bên ngoài từ nồi cách thủy điều chỉnh sao cho cao h n nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 5 - 10oC để quá trình chiết soxhlet cứ 30 - 45 phút dịch chiết được rút xuống 1 lần.
Chiết kiệt chất trong bột vỏ rễ chùm ruột trong 32 tiếng, kiểm tra đã chiết kiệt chưa bằng cách chấm một ít dịch trong hốc chiết lên miếng kính và để cho ung môi ay h i nếu trên miếng kính không có vết gì chứng tỏ đã chiết kiệt.
Đem ọc thu được các ịch chiết hexane, chloroform, methanol, ethanol. Sau đ ấy một phần ịch chiết đo phổ GC-MS tại Trung tâm ỹ thuật Tiêu chuẩn Đo ường Chất ượng II số 2- gô Quyền- Đà ẵng. Phần còn ại đem cô cạn thu được cao chiết của các ung môi đem cân ta được kết quả.
Hình 2.7. Hệ thống 4 bộ soxhlet dùng để chiết bột vỏ rễ chùm ruột với các dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, ethanol
2.3.4. Chƣơng trình chạy sắc ký GC-MS
Đo GC–MS xác định thành phần h a học c trong mỗi ịch chiết với chư ng tr nh chạy như sau:
- Cột sắc ký mao quản: HP-5: 30 m x 250 µm x 0.25 µm - Chư ng tr nh nhiệt độ lò cột
50 °C 0’) 120°C 165 °C 300 °C 10’) - Buồng tiêm mẫu
+ Nhiệt độ buồng tiêm mẫu : 280 °C + Áp suất : 7.6522 psi + Tỷ lệ chia dòng : 10 :1 + Thể tích tiêm : 1µl - Khối phổ + Khoảng phổ quét : 28 – 600 m/z + Nhiệt độ nguồn : 230oC
2.4. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT BỘT VỎ RỄ CHÙM RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHƢNG NINH
2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt đ đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
a. Ả h hưởng của thời gian: Tiến hành chưng ninh 6 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 700
C trong khoảng thời gian thay đổi
từ: 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đem ọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao
chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn thời gian chiết thích hợp là thời gian tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
b. Ả h hưởng của nhiệt độ sôi: Tiến hành chưng ninh 8 mẫu, mỗi mẫu tăng 7 °C/min tăng 1 °C/min tăng 30 °C/min
cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chưng ninh ở các nhiệt độ thay đổi từ: 45oC, 50oC, 60oC, 65oC,
70oC, 75oC, 80oC và 90oC, trong khoảng thời gian tốt nhất đã chọn là 8h. Đem
lọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn nhiệt độ chiết thích hợp là nhiệt độ tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ rắn - lỏng đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Chuẩn bị 6 mẫu cho lần ượt vào 6 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác trong khoảng 10gam sau đ cho ung môi ethano vào ở các thể tích thay đổi
40, 60, 80, 100, 120, 140ml. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C trong
khoảng thời gian thích hợp đã chọn là 8h.
Đem ọc đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết thu được cao chiết ở các nhiệt độ khác nhau. Đem cân ta được kết quả hàm ượng cao chiết.
2.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của số lần chiết đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Cân chính xác khoảng 30gam mẫu cho vào bình cầu 500m sau đ cho 300ml dung môi ethanol vào. Tiến hành chiết chưng ninh trong khoảng thời gian 8h với nhiệt độ là 800C.
Đem ọc thu được dịch chiết lần 1, còn bã sau khi lọc ta cho vào bình cầu, thêm vào 300ml dung môi ethanol tiếp tục đun trong thời gian và nhiệt độ trên.
Tư ng tự ta có dịch chiết lần 2, lần 3 và lần 4.
Cách tính hàm lƣợng cao chiết: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khối ượng cao chiết: m = m2 – m1
- Phần trăm cao chiết: X= 100% Trong đ :
m0: Khối ượng mẫu đem chiết. m1: Khối ượng cốc thuỷ tinh.
m2: Khối ượng cốc thuỷ tinh và cao chiết. m: Khối ượng cao chiểt.
X: Thành phần phần trăm cao chiết.
2.5. PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE CỦA VỎ RỄ CÂY CHÙM RUỘT
2.5.1. Chuẩn bị cao ethyl acetate
Cân 1kg mẫu ột vỏ rễ chùm ruột đã được xử . Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C, thời gian 8h. Dịch chiết sau 3 ần chiết chưng ninh gộp ại thu hồi dung môi rồi cô cạn thu được 247g cao ethanol.
Hình 2.8. Bộ chưng ninh dùng để điều chế cao ethanol của vỏ rễ chùm ruột.
òa tan cao ethano trong nước cất cho vào phễu chiết 1 ít. Tiến hành chiết ỏng - ỏng iên tục với dung môi hexane (200ml/lần x 3 lần) để loại chất béo thu được 2.232g cao hexane. Huyền phù còn lại chiết lỏng lỏng với dung môi ethyl acetate (200ml/lần x 6 lần). Dịch ethyl acetate tiến hành cô quay chân không thu được 5.015g cao ethyl acetate.
Hình 2.9. Chiết lỏng- lỏng bằng dung môi hexane
Hình 2.10. Chiết lỏng-lỏng bằng dung môi ethyl acetace.
2.5.2. Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng [8].
D c
- Tủ hút h i độc đ n tử ngoại máy ảnh máy sấy ản mỏng ụng cụ để phun thuốc thử.
- B nh triển khai ằng thủy tinh trong suốt c nắp đậy kín micropipet nhiều cỡ từ 1m đến 20 m và các ống mao quản.
Công thức pha dung dịch th ốc th h ệ à ( ung ịch vani in 1% trong axit sunfuric): Cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COO đậm đặc, khuấy đều sau đ cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1.2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi khuấy được cho vào bình thủy tinh màu tối đậy nút kín.
h ị h t h
B nh triển khai dạng h nh khối trụ hoặc khối chữ nhật c đường kính ớn h n ề ngang ản mỏng. Đặt một tờ giấy ọc ao phủ mặt trong của nh nhưng vẫn chừa một khoảng để c thể quan sát ên trong. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không bị ay h i trong quá trình giải ly.
Chu n bị bản mỏng chạy s c ký
Bản mỏng đã được tráng si icagel c kích thước 20x20 cm. Cắt ản mỏng ra thành những ản nhỏ c kích thước 1x10 cm. Dùng út ch mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép ưới ản mỏng 1cm mức tiền tuyến ung môi cách mép trên ản mỏng 0 5cm.
Chu n bị dịch chiết chạy s c ký
Cao ethyl acetate được hòa tan trong dung môi ethyl acetate, sao cho cao tan hoàn toàn
h ả mỏng và s d ng bình tri n khai
Cho ung môi giải y vào nh đến khi ớp ung môi ày khoảng 0,5 - 0,7 cm, để yên 5 - 10 phút để ão hòa h i ung môi trong nh nhờ tờ giấy ọc).
Dùng vi mao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dịch chiết ethyl acetate từ vỏ rễ chùm ruột ực mao ẫn sẽ hút ung ịch vào vi quản chấm nhẹ phần đầu nhọn chứa dung dịch ên trên ản mỏng tại một điểm cách ản 1cm điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng ản mỏng vào nh triển khai th điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của ung ịch giải y chứa trong nh).
Lư ý: Chạm nhẹ vi quản vào ề mặt ản mỏng để không nh n thấy ỗ trên ề mặt và chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ v nếu chạm âu điểm này sẽ an to). Thổi nhẹ ên vết chấm để ung môi ay h i nhanh không an thành vết chấm to. C thể chấm thêm ên ngay vết chấm cũ vài ần nữa để c vết đậm r đường kính không quá 2mm. ếu cần chấm cùng nhiều vết chấm ên một ản th các vết chấm phải cách đáy ản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh ên 1cm.
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào ung môi trong nh. hi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh ên của ản không chạm vào thành nh úc đ vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của ung môi khoảng 0 5cm.
Đậy nắp nh triển khai ung môi sẽ được hút ên ản ởi ực hút mao ẫn. Theo i khi mực ung môi ên đến vạch tiền tuyến ung môi đã được vạch sẵn trước đ cách đầu ản 0.5 cm) th ấy ản ra khỏi nh sấy khô ản ằng máy sấy.
ách h ệ h h vết c ý đ xác đị h f (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành việc àm hiện h nh vết sắc k ằng phư ng pháp h a học hoặc vật . Quan sát trong uồng soi UV ưới ánh sáng tử ngoại ước s ng 254nm và 366nm hoặc nhúng, phun xịt ung ịch thuốc thử hiện màu c thể tác ụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hỗn hợp màu nh n r ằng mắt thường và sấy khô bằng máy sấy trong 4 - 5 phút.
Nh x t v à c: Từ giá trị Rf của các vết thu được chọn hệ ung môi khai triển à hệ ung môi cho các vết tách riêng iệt r ràng.
Hình 2.13. uồng soi UV dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm
2.5.3. Chạy sắc ký c t cao ethyl acetate [8]
L chọ
Chọn ung môi hexane không phân cực để ổn định cột. Cho bản mỏng chạy trên hệ ung môi đ n từ không phân cực đến phân cực như hexane, ethyl acetate methano …thì thấy hexane cho các vết sát nhau, độ cao ở khoảng giữa của bản mỏng, ethyl acetate cho các vết kéo xa nhau và nh n r ràng h n, còn methanol thì kéo các vết lên nằm sát gần nhau về phía mức tuyền tuyến của bản mỏng. Trên c sở hệ ung môi đ n đ tổng hợp và chọn tỉ lệ hệ ung
môi hexane: ethyl acetate được tr nh ày dựa trên kết quả sắc ký bản mỏng:
ình 2.14. ết quả chạy sắc k bản mỏng với hệ dung môi he ane: ethyl acetate theo các t lệ 90:10, 80:20 và 70:30, 60:40, 50:50, 40:60 soi dưới đ n
UV tại bước sóng 366nm
Nh x t:
Với hệ ung môi hexane: ethy acetate
- Tỉ lệ 90:10 các cấu tử tách ra không r c hiện tượng kéo đuôi. -Tỉ lệ 80 : 20 các cấu tử tách ra không r
-Tỉ lệ 70:30, 60:40, 50:50 các cấu tử tách ra r h n. -Tỉ lệ 40:60 các cấu tử tách ra không r
Do đ tôi chọn hệ ung môi hexane: ethyl acetate = 70: 30 àm hệ ung môi khởi đầu sau đ tăng độ phân cực đến 60: 40 và kết thúc với hệ ung môi hexane: ethyl acetate = 50: 50
Nạ ch t h th ạ ệt và cột
Sử dụng cột sắc kí c đường kính 3.5cm và chiều cao làm việc của cột là 50 cm của Hoa Kỳ. Lấy cốc 500ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ khoảng 130 gam silicagel đã sấy ở 130oC trong vòng 10 tiếng vào và khuấy đều đặn để đuổi hết bọt khí. Chú ý, không r t trực tiếp ung môi vào chất hấp thu si icage ) ởi v chất hấp thu gặp ung môi sẽ phát nhiệt c thể àm chất
hấp thu v n cục sẽ không đồng nhất. ượng ung môi sử ụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 tiếng hoặc qua đêm để si icage trư ng nở hết trong hexane. Trước khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane: silicagel nếu hỗn hợp không c ạng sệt th thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt như vậy khi nhồi cột hỗn hợp mới c thể r t chảy xuống cột ễ àng. Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. ới ỏng kẹp để c thể xoay cột theo vòng tròn không nới kẹp rộng quá để tránh trường hợp cột không được giữ cố định c khả năng r i vỡ. Cho mẫu bông nhỏ vào đáy cột để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Dùng một phễu ọc c đuôi ài đặt trên đầu cột cho vào cột 1 ượng hexane (có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane: silicagel đã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua ông gòn, giúp cố định ông gòn ở ên ưới cột không ị ệch khỏi đáy cột trong úc cho hỗn hợp hexane: silicagel vào. Mở nhẹ kh a ở ên ưới cột và dùng ọ thủy tinh hứng hexane chảy ra ên ưới cột. Khi bông gòn đã được cố định ta vặn kh a ại và chú trong cột ây giờ vẫn còn ung ịch hexane cao khoảng 30cm so với chiều cao àm việc của cột. Đổ nhẹ từ từ hỗn hợp ở dạng sệt vào cột. Sau khi đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, ta xoay nhẹ cột theo vòng tròn và ùng một thanh cao su g nhẹ quanh thành cột từ ưới ên trên để chất hấp thu nén đều trong cột và không ị ỏng. Tiến hành mở nhẹ kh a ở ên ưới cột để ung môi hexane tiếp tục chảy ra từ từ và hứng vào một ọ thủy tinh trống để ở ên ưới cột, hexane sau khi hứng ại được r t vào đầu cột sắc k . Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành iên tục như vậy cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột được chặt chẽ cho thấy chất hấp thu trong cột c ạng đồng nhất.
Ta phải àm cho mặt thoáng chất hấp thu (silicagel) ở đầu cột nằm ngang. ếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho ung môi thêm ên trên
phần đầu cột ùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần ung môi gần sát mặt thoáng àm xáo trộn một phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đ để yên chất hấp thu ắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng ằng phẳng. Để ổn định cột qua đêm nhằm tránh t nh trạng trạng nứt cột.
Nạp mẫu vào cột ở dạng khô
Cao chiết ethyl acetate 5 015g) đem trộn với silicagel vừa đủ rồi đem cô quay chân không đến khô hoàn toàn. Lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ thu được mẫu cao đã thấm đều bề mặt silicagel. Cho mẫu cao này vào cột đã nộp silicagel) qua phễu nhỏ một cách từ từ để tránh tạo bọt khí và vón cục. Phủ lên trên mẫu 1 lớp silicagel mỏng nữa và cho 1 ít dung môi hexane ở trên đầu cột, để cột ổn định qua 3 tiếng.
Tiến hành chạy cột với hệ dung môi rửa giải hexane: ethyl acetate tăng dần độ phân cực (hệ ung môi an đầu hexane: ethyl acetate = 70:30), tốc độ hứng 10÷12 giọt/ phút. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ nhỏ 15ml.
Hình 2.15. Sắc ký cột cao ethyl acetate (d= 35mm, h= 50cm)
h á t h ả
ứng ung ịch giải y trong những ọ c đánh số thứ tự, mỗi ọ hứng khoảng 15 ml. Kết quả thu được 40 lọ, tiến hành ay h i tự nhiên cho đến khi
thể tích mỗi ọ còn khoảng 5m th tiến hành sắc k ản mỏng.
Hình 2.16. Các lọ dung dịch hứng (15ml)
Những lọ cho sắc ký bản mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 7 phân đoạn phân đoạn EAI ( từ lọ thứ 1 đến lọ thứ 3) 0.053g phân đoạn EAII ( từ lọ thứ 4 đến lọ thứ 6) 0.147g phân đoạn EAIII (từ lọ thứ 7 đến lọ thứ 9) 0.078g phân đoạn EAIV (từ lọ thứ 10 đến lọ thứ 30) 1.053g phân đoạn EAV ( từ lọ 31 đến lọ 33) 0.118g phân đoạn EAVI ( từ lọ 34 đến lọ 37) 0.169g phân đoạn EAVII ( từ lọ 38 đến lọ 40) 0.073g. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chọ hâ đ ạn tiếp t c khảo sát
Phân đoạn EAIV (từ lọ thứ 10 đến lọ thứ 30) có khối ượng cao là 1.053g, đem trộn với silicagel và giã mịn
Hình 2.17. Cao phân đoạn EAIV trộn với silicagel và giã mịn
Tiến hành sắc ký bản mỏng với phân đoạn EAIV, với hệ ung môi đ n từ không phân cực đến phân cực: hexane, dichloromethane, chloroform,
ethyl acetate. Ta thấy hexane không kéo vệt, ethyl acetate cho các vết kéo