6. Bố cục uận văn
2.5.2.Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng
D c
- Tủ hút h i độc đ n tử ngoại máy ảnh máy sấy ản mỏng ụng cụ để phun thuốc thử.
- B nh triển khai ằng thủy tinh trong suốt c nắp đậy kín micropipet nhiều cỡ từ 1m đến 20 m và các ống mao quản.
Công thức pha dung dịch th ốc th h ệ à ( ung ịch vani in 1% trong axit sunfuric): Cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COO đậm đặc, khuấy đều sau đ cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1.2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi khuấy được cho vào bình thủy tinh màu tối đậy nút kín.
h ị h t h
B nh triển khai dạng h nh khối trụ hoặc khối chữ nhật c đường kính ớn h n ề ngang ản mỏng. Đặt một tờ giấy ọc ao phủ mặt trong của nh nhưng vẫn chừa một khoảng để c thể quan sát ên trong. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không bị ay h i trong quá trình giải ly.
Chu n bị bản mỏng chạy s c ký
Bản mỏng đã được tráng si icagel c kích thước 20x20 cm. Cắt ản mỏng ra thành những ản nhỏ c kích thước 1x10 cm. Dùng út ch mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép ưới ản mỏng 1cm mức tiền tuyến ung môi cách mép trên ản mỏng 0 5cm.
Chu n bị dịch chiết chạy s c ký
Cao ethyl acetate được hòa tan trong dung môi ethyl acetate, sao cho cao tan hoàn toàn
h ả mỏng và s d ng bình tri n khai
Cho ung môi giải y vào nh đến khi ớp ung môi ày khoảng 0,5 - 0,7 cm, để yên 5 - 10 phút để ão hòa h i ung môi trong nh nhờ tờ giấy ọc).
Dùng vi mao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dịch chiết ethyl acetate từ vỏ rễ chùm ruột ực mao ẫn sẽ hút ung ịch vào vi quản chấm nhẹ phần đầu nhọn chứa dung dịch ên trên ản mỏng tại một điểm cách ản 1cm điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng ản mỏng vào nh triển khai th điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của ung ịch giải y chứa trong nh).
Lư ý: Chạm nhẹ vi quản vào ề mặt ản mỏng để không nh n thấy ỗ trên ề mặt và chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ v nếu chạm âu điểm này sẽ an to). Thổi nhẹ ên vết chấm để ung môi ay h i nhanh không an thành vết chấm to. C thể chấm thêm ên ngay vết chấm cũ vài ần nữa để c vết đậm r đường kính không quá 2mm. ếu cần chấm cùng nhiều vết chấm ên một ản th các vết chấm phải cách đáy ản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh ên 1cm.
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào ung môi trong nh. hi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh ên của ản không chạm vào thành nh úc đ vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của ung môi khoảng 0 5cm.
Đậy nắp nh triển khai ung môi sẽ được hút ên ản ởi ực hút mao ẫn. Theo i khi mực ung môi ên đến vạch tiền tuyến ung môi đã được vạch sẵn trước đ cách đầu ản 0.5 cm) th ấy ản ra khỏi nh sấy khô ản ằng máy sấy.
ách h ệ h h vết c ý đ xác đị h f
Tiến hành việc àm hiện h nh vết sắc k ằng phư ng pháp h a học hoặc vật . Quan sát trong uồng soi UV ưới ánh sáng tử ngoại ước s ng 254nm và 366nm hoặc nhúng, phun xịt ung ịch thuốc thử hiện màu c thể tác ụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hỗn hợp màu nh n r ằng mắt thường và sấy khô bằng máy sấy trong 4 - 5 phút.
Nh x t v à c: Từ giá trị Rf của các vết thu được chọn hệ ung môi khai triển à hệ ung môi cho các vết tách riêng iệt r ràng.
Hình 2.13. uồng soi UV dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm
2.5.3. Chạy sắc ký c t cao ethyl acetate [8]
L chọ
Chọn ung môi hexane không phân cực để ổn định cột. Cho bản mỏng chạy trên hệ ung môi đ n từ không phân cực đến phân cực như hexane, ethyl acetate methano …thì thấy hexane cho các vết sát nhau, độ cao ở khoảng giữa của bản mỏng, ethyl acetate cho các vết kéo xa nhau và nh n r ràng h n, còn methanol thì kéo các vết lên nằm sát gần nhau về phía mức tuyền tuyến của bản mỏng. Trên c sở hệ ung môi đ n đ tổng hợp và chọn tỉ lệ hệ ung
môi hexane: ethyl acetate được tr nh ày dựa trên kết quả sắc ký bản mỏng:
ình 2.14. ết quả chạy sắc k bản mỏng với hệ dung môi he ane: ethyl acetate theo các t lệ 90:10, 80:20 và 70:30, 60:40, 50:50, 40:60 soi dưới đ n
UV tại bước sóng 366nm
Nh x t:
Với hệ ung môi hexane: ethy acetate
- Tỉ lệ 90:10 các cấu tử tách ra không r c hiện tượng kéo đuôi. -Tỉ lệ 80 : 20 các cấu tử tách ra không r
-Tỉ lệ 70:30, 60:40, 50:50 các cấu tử tách ra r h n. -Tỉ lệ 40:60 các cấu tử tách ra không r
Do đ tôi chọn hệ ung môi hexane: ethyl acetate = 70: 30 àm hệ ung môi khởi đầu sau đ tăng độ phân cực đến 60: 40 và kết thúc với hệ ung môi hexane: ethyl acetate = 50: 50 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nạ ch t h th ạ ệt và cột
Sử dụng cột sắc kí c đường kính 3.5cm và chiều cao làm việc của cột là 50 cm của Hoa Kỳ. Lấy cốc 500ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ khoảng 130 gam silicagel đã sấy ở 130oC trong vòng 10 tiếng vào và khuấy đều đặn để đuổi hết bọt khí. Chú ý, không r t trực tiếp ung môi vào chất hấp thu si icage ) ởi v chất hấp thu gặp ung môi sẽ phát nhiệt c thể àm chất
hấp thu v n cục sẽ không đồng nhất. ượng ung môi sử ụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 tiếng hoặc qua đêm để si icage trư ng nở hết trong hexane. Trước khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane: silicagel nếu hỗn hợp không c ạng sệt th thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt như vậy khi nhồi cột hỗn hợp mới c thể r t chảy xuống cột ễ àng. Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. ới ỏng kẹp để c thể xoay cột theo vòng tròn không nới kẹp rộng quá để tránh trường hợp cột không được giữ cố định c khả năng r i vỡ. Cho mẫu bông nhỏ vào đáy cột để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Dùng một phễu ọc c đuôi ài đặt trên đầu cột cho vào cột 1 ượng hexane (có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane: silicagel đã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua ông gòn, giúp cố định ông gòn ở ên ưới cột không ị ệch khỏi đáy cột trong úc cho hỗn hợp hexane: silicagel vào. Mở nhẹ kh a ở ên ưới cột và dùng ọ thủy tinh hứng hexane chảy ra ên ưới cột. Khi bông gòn đã được cố định ta vặn kh a ại và chú trong cột ây giờ vẫn còn ung ịch hexane cao khoảng 30cm so với chiều cao àm việc của cột. Đổ nhẹ từ từ hỗn hợp ở dạng sệt vào cột. Sau khi đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, ta xoay nhẹ cột theo vòng tròn và ùng một thanh cao su g nhẹ quanh thành cột từ ưới ên trên để chất hấp thu nén đều trong cột và không ị ỏng. Tiến hành mở nhẹ kh a ở ên ưới cột để ung môi hexane tiếp tục chảy ra từ từ và hứng vào một ọ thủy tinh trống để ở ên ưới cột, hexane sau khi hứng ại được r t vào đầu cột sắc k . Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành iên tục như vậy cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột được chặt chẽ cho thấy chất hấp thu trong cột c ạng đồng nhất.
Ta phải àm cho mặt thoáng chất hấp thu (silicagel) ở đầu cột nằm ngang. ếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho ung môi thêm ên trên
phần đầu cột ùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần ung môi gần sát mặt thoáng àm xáo trộn một phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đ để yên chất hấp thu ắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng ằng phẳng. Để ổn định cột qua đêm nhằm tránh t nh trạng trạng nứt cột.
Nạp mẫu vào cột ở dạng khô
Cao chiết ethyl acetate 5 015g) đem trộn với silicagel vừa đủ rồi đem cô quay chân không đến khô hoàn toàn. Lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ thu được mẫu cao đã thấm đều bề mặt silicagel. Cho mẫu cao này vào cột đã nộp silicagel) qua phễu nhỏ một cách từ từ để tránh tạo bọt khí và vón cục. Phủ lên trên mẫu 1 lớp silicagel mỏng nữa và cho 1 ít dung môi hexane ở trên đầu cột, để cột ổn định qua 3 tiếng.
Tiến hành chạy cột với hệ dung môi rửa giải hexane: ethyl acetate tăng dần độ phân cực (hệ ung môi an đầu hexane: ethyl acetate = 70:30), tốc độ hứng 10÷12 giọt/ phút. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ nhỏ 15ml.
Hình 2.15. Sắc ký cột cao ethyl acetate (d= 35mm, h= 50cm)
h á t h ả
ứng ung ịch giải y trong những ọ c đánh số thứ tự, mỗi ọ hứng khoảng 15 ml. Kết quả thu được 40 lọ, tiến hành ay h i tự nhiên cho đến khi
thể tích mỗi ọ còn khoảng 5m th tiến hành sắc k ản mỏng.
Hình 2.16. Các lọ dung dịch hứng (15ml)
Những lọ cho sắc ký bản mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 7 phân đoạn phân đoạn EAI ( từ lọ thứ 1 đến lọ thứ 3) 0.053g phân đoạn EAII ( từ lọ thứ 4 đến lọ thứ 6) 0.147g phân đoạn EAIII (từ lọ thứ 7 đến lọ thứ 9) 0.078g phân đoạn EAIV (từ lọ thứ 10 đến lọ thứ 30) 1.053g phân đoạn EAV ( từ lọ 31 đến lọ 33) 0.118g phân đoạn EAVI ( từ lọ 34 đến lọ 37) 0.169g phân đoạn EAVII ( từ lọ 38 đến lọ 40) 0.073g.
Chọ hâ đ ạn tiếp t c khảo sát
Phân đoạn EAIV (từ lọ thứ 10 đến lọ thứ 30) có khối ượng cao là 1.053g, đem trộn với silicagel và giã mịn
Hình 2.17. Cao phân đoạn EAIV trộn với silicagel và giã mịn
Tiến hành sắc ký bản mỏng với phân đoạn EAIV, với hệ ung môi đ n từ không phân cực đến phân cực: hexane, dichloromethane, chloroform,
ethyl acetate. Ta thấy hexane không kéo vệt, ethyl acetate cho các vết kéo sát nhau và nhìn không rõ ràng, còn dichlometan thì kéo các vết lên nằm h i xa nhau, chloroform thì các vết h i sát nhau. Trên c sở hệ ung môi đ n đ tổng hợp và chọn tỉ lệ hệ ung môi dichloromethane: ch oro orm để tiếp tục chấm bản mỏng.
ình 2.18. ết quả chạy sắc k bản mỏng với hệ dung môi đơn he ane dichloromethane, chloroform ethyl acetate soi dưới đ n UV tại
bước sóng 365nm
Tiến hành chấm bản mỏng để chọn tỉ lệ của hệ dichloromethane: ch oro orm để chạy cột sắc ký tiếp theo ở phân đoạn EAIV.
ình 2.19. ết quả chạy sắc k bản mỏng với hệ dung môi dichloromethane: chloroform theo các t lệ 80:20 70:30 và 60:40 50:50 40:60 30:70 soi dưới
Nh x t:
Với hệ ung môi dichloromethane: chloroform
- Tỉ lệ 80:20, 70:30 các cấu tử tách ra không r c hiện tượng kéo đuôi. - Tỉ lệ 60:40, 50:50, 40:60 các cấu tử tách ra r h n.
- Tỉ lệ 30:70 các cấu tử tách ra không r
Do đ tôi chọn hệ ung môi dichloromethane : chloroform: = 60: 40 àm hệ ung môi khởi đầu sau đ tăng ần độ phân cực cho tới hệ ung môi dichloromethane:chloroform = 50:50 và kết thúc với hệ dung môi dichloromethane: chloroform = 40: 60 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chạy cột s c ý hâ đ ạn EAIV
Sử dụng cột sắc k c đường kính 1.0 cm, chiều cao 40cm. Tiến hành giải ly với tốc độ 4 - 5 giọt/ phút. Hứng vào các lọ thủy tinh, mỗi lọ 15ml.Thu được 20 lọ, cho ay h i tự nhiên đến khi mỗi lọ còn lại khoảng 5ml thì tiến hành sắc ký bản mỏng.
Hình 2.20. Sắc ký cột phân đoạn EAIV (d= 1.0cm, h= 40cm)
Những lọ cho sắc ký bản mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Dựa vào kết quả sắc ký bản mỏng, thu được 2 phân đoạn. Phân đoạn AaI (từ lọ thứ 1 đến lọ thứ 9) 0.105g phân đoạn AaII (từ lọ thứ 10 đến lọ thứ 20) 0.201g. Đem các phân đoạn AaI và AaII đi đo GC/ MS.
Hình 2.21. a) Cao phân đoạn AaI b) Cao phân đoạn AaII
2.6. PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.6.1. Thử hoạt tính kháng khuẩn
Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phư ng pháp khuếch tán qua giếng thạch với các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) tại Trung tâm chất ượng Nông Lâm Thuỷ sản vùng 2- NAFIQAD- 31 gũ ành S n Đà ẵng.
Nguyên liệu
- Dịch chiết từ bột vỏ rễ chùm ruột trong dung môi ethanol. Tiến hành chưng ninh ở nhiệt độ 500
C, trong thời gian 8h. - Một số chủng vi sinh vật kiểm định.
Ki định khả ă há v h n gây bệnh
- Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli.
Salmonella typhi.
- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis.
Hóa ch t
Môi trường ùng để nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường cao thịt-pepton - Cao thịt: 3g/l
- Agar:10g/l
- Pepton: 10g/l - NaCl: 5/l
- pH: 6,0
D ng c
- Pipet. - Bông không thấm nước. - Tủ ủ, tủ lạnh. - Đ n cồn
- Cân phân tích. - Đĩa petri
- Dụng cụ chiết. - Đũa thủy tinh. - Ống nghiệm
- Tủ cấy vi sinh. - Cốc thủy tinh.
- Máy quang phổ. - Que cấy, que gắp.
- Thước đo cm mm. - Giá để ống nghiệm
Nguyên t c: Ức chế tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị bằng dịch chiết từ vỏ rễ chùm ruột. Kiểm tra bằng khả năng khuếch tán qua giếng thạch.
Cách th c hiện:
- Trên môi trường agar trải VSV chỉ thị vào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dùng ống nhôm đục hai lỗ trên thạch đường kính 8 mm.
- Lấy 0,1ml dịch chiết vỏ rễ chùm ruột cho vào một lỗ, còn một lỗ cho vào 1 m nước cất để àm đối chứng.
- Cho vào tủ lạnh 4oC trong thời gian 5 ÷ 6 giờ để cho dịch chiết khuếch tán ra môi trường.
(Escherichia coli 37oC, 18 ÷ 24 giờ; Staphylococcus aureus 37oC, 16 ÷ 24 giờ). - Quá tr nh đục lỗ: tất cả quá trình thực hiện bên trong tủ cấy vô trùng, mở nắp đĩa petri ùng ống nhôm đường kính 8 mm khử trùng trên ngọn lửa đ n cồn. Đục lỗ trên thạch. Đậy nắp đĩa ại.
2.6.2. Khảo sát tính chống oxy hóa bằng phƣơng pháp bẫy gốc tự do DPPH●
Để khảo sát tính chống oxy hóa của bột vỏ rễ chùm ruột chúng tôi đã sử dụng phư ng pháp ẫy gốc tự do DPPH.
Nguyên t c
Trong thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự o được ùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPP được xác định bằng phư ng pháp đo quang ở ước s ng λ= 517nm. Các chất có khả năng kháng oxy h a sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại, màu dung dịch nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng.
Cách tiến hành
Pha dung dịch DPPH có nồng độ 500µM trong ethanol . Chất thử được pha trong ethanol tuyệt đối sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 100; 50; 25; 10 µM/m . Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37oC đọc mật độ hấp thụ của DPP chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở ước s ng 517nm. ci ascor ic được sử dụng làm chất đối chiếu.
Tính toán kết quả
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.1.1. Đ ẩm 3.1.1. Đ ẩm
Số ượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu. Độ ẩm chung à độ