6. Bố cục uận văn
2.1.2. Xử lí nguyên liệu
Vỏ rễ chùm ruột sau khi được rửa sạch, để khô trong không khí sau đ nghiền nhỏ, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp nhựa có nắp.
Hình 2.3. Hộp nhựa đựng bột vỏ rễ chùm ruột sau khi nghiền nhỏ
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. h ết ị c
- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent (tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo ường chất ượng 2- Đà ẵng).
- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer (phòng thí nghiệm khoa Sinh- Môi trường trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng).
- Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách thủy, sinh hàn hồi ưu cốc thủy tinh đũa thủy tinh, bình tam giác, ống đong ếp điện, phễu lọc, phễu chiết, các loại pipet nh định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, bản mỏng, cột chạy sắc ký...
b. ch t
Bảng 2.1. Hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm
STT Tên hóa chất Đ tinh khiết Tiêu
chuẩn Nguồn gốc
1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
STT Tên hóa chất Đ tinh khiết Tiêu
chuẩn Nguồn gốc
6 Dung dịch H2SO4 Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc 7 Dung dịch HNO3 Đậm đặc (63%) TCCS Trung Quốc 8 Dung dịch CH3COOH Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc
9 Silicagel Tinh khiết TCCS Đức
10 Vanilin Thư ng mại TCCS Trung Quốc
2.1.4. Sơ đồ chiết tách bằng phƣơng pháp chiết soxhlet
Thu hái và xử lí
Chiết song song
Cô Cô Cô Cô
Hình 2.4. Sơ đồ chiết tách bằng phương pháp soxhlet
Cao chloroform Vỏ rễ chùm ruột Bột vỏ rễ Xác định chỉ tiêu hóa lý Độ ẩm àm ượng tro àm ượng kim loại Dịch chiết hexane Dịch chiết chloroform Dịch chiết ethanol Dịch chiết methanol Cao hexane Cao ethanol Cao methanol - Cân xác định khối ượng - Định danh bằng phổ GC/MS
2.1.5. Sơ đồ chiết tách, xác định thành phần hóa học của các phân đoạn từ tổng cao ethanol
chưng ninh
làm bay hơi
dung môi
phân tán vào nước Cô
chiết lỏng lỏng bằng hexane
chiết lỏng lỏng bằng ethyl acetate
Cô cạn Cô cạn phân lập phân đoạn
ình 2.5. Sơ đồ điều chế cao chiết
Vỏ rễ chùm ruột Dịch chiết ethanol Dịch chiết ethanol Cao tổng ethanol Huyền phù Huyền phù Dịch hexane
Cao hexane Huyền phù
còn lại Dịch ethyl acetate Cao ethyl acetate - Đo GC/MS. Chạy sắc kí cột , sắc kí bản mỏng Đo GC/MS Thử hoạt tính sinh học
2.2. XÁC ĐỊNH CÁC TH NG SỐ HÓA LÝ CỦA VỎ RỄ CHÙM RUỘT 2.2.1. Xác định đ ẩm [10]
N t c
Dùng sức n ng àm ay h i hết h i nước trong mẫu. Cân trọng ượng mẫu trước và sau khi sấy khô từ đ tính ra phần trăm nước c trong mẫu.
ách t ế hà h
Chuẩn bị 3 chén sứ và đánh số thứ tự 1 đến 3, các cốc sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối ượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối ượng các chén sứ.
Xác định độ ẩm của bột vỏ rễ cây chùm ruột: cho vào mỗi cốc sứ m g bột và cân khối ượng cả chén và bột. Ghi lại giá trị khối ượng (m1). Sau đ tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 90oC, sau 3h lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội hẳn th đêm cân. Ghi ại giá trị khối ượng (m2).
c. Tính toán kết quả
- Độ ẩm mỗi mẫu: W(%) = 100% - Độ ẩm trung bình WTB(%) = 100%
Trong đ : m: Khối ượng mẫu bột (g).
m1: Khối ượng chén và mẫu bột trước khi sấy (g). m2: Khối ượng chén và mẫu bột sau khi sấy (g). W: Độ ẩm của mỗi mẫu (%).
WTB: Độ ẩm trung bình (%).
2.2.2. Xác định hàm lƣợng tro [11] a. Nguyê t c
Để xác định hàm ượng hữu c tổng và các nguyên tố vô c trong c thể động – thực vật người ta ùng phư ng pháp tro h a mẫu. Mẫu được xử s ộ sau đ đem nung ở nhiệt độ 450-500oC trong chén sứ chịu nhiệt. Các chất
hữu c ị đốt cháy trong tro còn ại các chất vô c kh ay h i. hối ượng chất hữu c tổng được tính à tổng chất hữu c ị đốt cháy và à hiệu số giữa khối ượng mẫu an đầu và khối ượng tro sau khi nung.
ách t ế hà h
Lấy cốc sứ sau khi đã xác định độ ẩm đem tro hoá trong ò nung ở nhiệt độ 600o
C. Sau thời gian 20h, ta thấy tro ở dạng bột mịn, màu trắng xám. Dùng kẹp sắt lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân. Ghi khối ượng (m3).
c. Tính toán kết quả
- àm ượng tro mỗi mẫu: H(%) = 100% - àm ượng tro trung bình: HTB(%) = 100% Trong đ : m: Khối ượng mẫu bột (g).
m0: Khối ượng chén sứ
m3: Khối ượng chén và mẫu bột sau khi tro hoá (g). : àm ượng tro trong bột vỏ rễ cây chùm ruột (%). HTB: àm ượng tro trung bình.
Hình 2.6. Mẫu bột vỏ rễ chùm ruột đã tro hóa
2.2.3. Xác định hàm lƣợng kim loại [1]
N t c
ách t ế hà h
Tro thu được sau khi nung đem hoà tan ằng dung dịch nước cường toan (3ml HCl và 1ml HNO3) định mức bằng nước cất đến 50ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm ượng một số kim loại nặng à Cu P s… bằng phư ng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà ẵng. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử với hiệu chỉnh nền Zeeman và Deuterium cho hoạt động với ngọn lửa và lò graphite gia nhiệt ngang của Analytik- Jena. Nhiệt độ nước làm mát tuần hoàn 3800C, tốc độ 3 ít/phút kích thước máy 260/660/560 mm.
c h ết ả
Công thức chuyển đổi hàm ượng mg/l sang mg/kg:
( / ) (mg/ l) 1000 mg kg C V n C
Trong đ : n: Khối ượng mẫu bột (g). V: Thể tich định mức (ml).
2.3. CHIẾT SOXLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ VỎ RỄ CHÙM RUỘT
2.3.1. Nguyên tắc
Chiết soxhlet là một kiểu chiết liên tục được thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết. Kiểu chiết này cũng như à kiểu chiết lỏng - lỏng nên về bản chất của quá trình chiết à tuân theo định luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Trong đ pha rắn nằm trong mẫu sẽ được hòa tan bởi pha lỏng gọi là dung môi.
2.3.2. Dụng cụ
2.3.3. Cách tiến hành
Chuẩn ị 4 túi vải cho 15g ột vỏ rễ chùm ruột vào mỗi túi sau đ tiến hành chiết soxhlet trong 200ml với các dung môi hexane, chloroform, methanol và ethanol bằng cách sử dụng nhiệt độ từ nồi cách thủy. ưu đặt vài viên i thủy tinh ưới đáy ống để tránh àm nghẹt ối ra vào của ống thông nhau. hông được để ượng ột vỏ rễ cây trong ống cao h n vượt h n mức cong của ống thông nhau.
Về c ản nhiệt độ bên ngoài từ nồi cách thủy điều chỉnh sao cho cao h n nhiệt độ sôi của dung môi khoảng 5 - 10oC để quá trình chiết soxhlet cứ 30 - 45 phút dịch chiết được rút xuống 1 lần.
Chiết kiệt chất trong bột vỏ rễ chùm ruột trong 32 tiếng, kiểm tra đã chiết kiệt chưa bằng cách chấm một ít dịch trong hốc chiết lên miếng kính và để cho ung môi ay h i nếu trên miếng kính không có vết gì chứng tỏ đã chiết kiệt.
Đem ọc thu được các ịch chiết hexane, chloroform, methanol, ethanol. Sau đ ấy một phần ịch chiết đo phổ GC-MS tại Trung tâm ỹ thuật Tiêu chuẩn Đo ường Chất ượng II số 2- gô Quyền- Đà ẵng. Phần còn ại đem cô cạn thu được cao chiết của các ung môi đem cân ta được kết quả.
Hình 2.7. Hệ thống 4 bộ soxhlet dùng để chiết bột vỏ rễ chùm ruột với các dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, ethanol
2.3.4. Chƣơng trình chạy sắc ký GC-MS
Đo GC–MS xác định thành phần h a học c trong mỗi ịch chiết với chư ng tr nh chạy như sau:
- Cột sắc ký mao quản: HP-5: 30 m x 250 µm x 0.25 µm - Chư ng tr nh nhiệt độ lò cột
50 °C 0’) 120°C 165 °C 300 °C 10’) - Buồng tiêm mẫu
+ Nhiệt độ buồng tiêm mẫu : 280 °C + Áp suất : 7.6522 psi + Tỷ lệ chia dòng : 10 :1 + Thể tích tiêm : 1µl - Khối phổ + Khoảng phổ quét : 28 – 600 m/z + Nhiệt độ nguồn : 230oC
2.4. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT BỘT VỎ RỄ CHÙM RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHƢNG NINH
2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt đ đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
a. Ả h hưởng của thời gian: Tiến hành chưng ninh 6 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 700
C trong khoảng thời gian thay đổi
từ: 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đem ọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao
chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn thời gian chiết thích hợp là thời gian tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
b. Ả h hưởng của nhiệt độ sôi: Tiến hành chưng ninh 8 mẫu, mỗi mẫu tăng 7 °C/min tăng 1 °C/min tăng 30 °C/min
cân chính xác khoảng 10g bột vỏ rễ chùm ruột trong 100ml dung môi ethanol. Tiến hành chưng ninh ở các nhiệt độ thay đổi từ: 45oC, 50oC, 60oC, 65oC,
70oC, 75oC, 80oC và 90oC, trong khoảng thời gian tốt nhất đã chọn là 8h. Đem
lọc và cô cạn các dịch chiết thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau cân cao thu được. Chọn nhiệt độ chiết thích hợp là nhiệt độ tư ng ứng với khối ượng cao lớn nhất.
2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ rắn - lỏng đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Chuẩn bị 6 mẫu cho lần ượt vào 6 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác trong khoảng 10gam sau đ cho ung môi ethano vào ở các thể tích thay đổi
40, 60, 80, 100, 120, 140ml. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C trong
khoảng thời gian thích hợp đã chọn là 8h.
Đem ọc đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết thu được cao chiết ở các nhiệt độ khác nhau. Đem cân ta được kết quả hàm ượng cao chiết.
2.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của số lần chiết đến quá trình chiết b t vỏ rễ chùm ru t
Cân chính xác khoảng 30gam mẫu cho vào bình cầu 500m sau đ cho 300ml dung môi ethanol vào. Tiến hành chiết chưng ninh trong khoảng thời gian 8h với nhiệt độ là 800C.
Đem ọc thu được dịch chiết lần 1, còn bã sau khi lọc ta cho vào bình cầu, thêm vào 300ml dung môi ethanol tiếp tục đun trong thời gian và nhiệt độ trên.
Tư ng tự ta có dịch chiết lần 2, lần 3 và lần 4.
Cách tính hàm lƣợng cao chiết:
- Khối ượng cao chiết: m = m2 – m1
- Phần trăm cao chiết: X= 100% Trong đ :
m0: Khối ượng mẫu đem chiết. m1: Khối ượng cốc thuỷ tinh.
m2: Khối ượng cốc thuỷ tinh và cao chiết. m: Khối ượng cao chiểt.
X: Thành phần phần trăm cao chiết.
2.5. PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE CỦA VỎ RỄ CÂY CHÙM RUỘT
2.5.1. Chuẩn bị cao ethyl acetate
Cân 1kg mẫu ột vỏ rễ chùm ruột đã được xử . Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C, thời gian 8h. Dịch chiết sau 3 ần chiết chưng ninh gộp ại thu hồi dung môi rồi cô cạn thu được 247g cao ethanol.
Hình 2.8. Bộ chưng ninh dùng để điều chế cao ethanol của vỏ rễ chùm ruột.
òa tan cao ethano trong nước cất cho vào phễu chiết 1 ít. Tiến hành chiết ỏng - ỏng iên tục với dung môi hexane (200ml/lần x 3 lần) để loại chất béo thu được 2.232g cao hexane. Huyền phù còn lại chiết lỏng lỏng với dung môi ethyl acetate (200ml/lần x 6 lần). Dịch ethyl acetate tiến hành cô quay chân không thu được 5.015g cao ethyl acetate.
Hình 2.9. Chiết lỏng- lỏng bằng dung môi hexane
Hình 2.10. Chiết lỏng-lỏng bằng dung môi ethyl acetace.
2.5.2. Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng [8].
D c
- Tủ hút h i độc đ n tử ngoại máy ảnh máy sấy ản mỏng ụng cụ để phun thuốc thử.
- B nh triển khai ằng thủy tinh trong suốt c nắp đậy kín micropipet nhiều cỡ từ 1m đến 20 m và các ống mao quản.
Công thức pha dung dịch th ốc th h ệ à ( ung ịch vani in 1% trong axit sunfuric): Cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COO đậm đặc, khuấy đều sau đ cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1.2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi khuấy được cho vào bình thủy tinh màu tối đậy nút kín.
h ị h t h
B nh triển khai dạng h nh khối trụ hoặc khối chữ nhật c đường kính ớn h n ề ngang ản mỏng. Đặt một tờ giấy ọc ao phủ mặt trong của nh nhưng vẫn chừa một khoảng để c thể quan sát ên trong. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không bị ay h i trong quá trình giải ly.
Chu n bị bản mỏng chạy s c ký
Bản mỏng đã được tráng si icagel c kích thước 20x20 cm. Cắt ản mỏng ra thành những ản nhỏ c kích thước 1x10 cm. Dùng út ch mũi nhọn vạch mức xuất phát cách mép ưới ản mỏng 1cm mức tiền tuyến ung môi cách mép trên ản mỏng 0 5cm.
Chu n bị dịch chiết chạy s c ký
Cao ethyl acetate được hòa tan trong dung môi ethyl acetate, sao cho cao tan hoàn toàn
h ả mỏng và s d ng bình tri n khai
Cho ung môi giải y vào nh đến khi ớp ung môi ày khoảng 0,5 - 0,7 cm, để yên 5 - 10 phút để ão hòa h i ung môi trong nh nhờ tờ giấy ọc).
Dùng vi mao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dịch chiết ethyl acetate từ vỏ rễ chùm ruột ực mao ẫn sẽ hút ung ịch vào vi quản chấm nhẹ phần đầu nhọn chứa dung dịch ên trên ản mỏng tại một điểm cách ản 1cm điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng ản mỏng vào nh triển khai th điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của ung ịch giải y chứa trong nh).
Lư ý: Chạm nhẹ vi quản vào ề mặt ản mỏng để không nh n thấy ỗ trên ề mặt và chỉ tạo thành một điểm tròn nhỏ v nếu chạm âu điểm này sẽ an to). Thổi nhẹ ên vết chấm để ung môi ay h i nhanh không an thành vết chấm to. C thể chấm thêm ên ngay vết chấm cũ vài ần nữa để c vết đậm r đường kính không quá 2mm. ếu cần chấm cùng nhiều vết chấm ên một ản th các vết chấm phải cách đáy ản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh ên 1cm.
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào ung môi trong nh. hi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh ên của ản không chạm vào thành nh úc đ vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của ung môi khoảng 0 5cm.
Đậy nắp nh triển khai ung môi sẽ được hút ên ản ởi ực hút mao ẫn. Theo i khi mực ung môi ên đến vạch tiền tuyến ung môi đã được vạch sẵn trước đ cách đầu ản 0.5 cm) th ấy ản ra khỏi nh sấy khô ản