CÔNG VIỆC 1.3: Nuôi cách ly nguồn vật liệu bổ sung

Dựa trên kỹ thuật nuôi cách ly cá nhập nội áp dụng trong Đề tài nhiệm vụ

cơ sở ‘Hình thành nguồn vật liệu ban đầu cho chọn giống cá rô phi đỏ’

năm 2008. Dụng cụ nuôi cách ly là các bể nhựa thể tích 1,5 m3 đặt ở một khu vực biệt lập. Trước khi thả cá, bể được xử lý bằng Chlorin nồng độ 50 mg/l. Nước cấp cho bể được xử lý bằng Chlorin nồng độ 30 ppm và sục khí mạnh trong 2 ngày trước khi thả cá. Cá được tắm bằng thuốc tím (KMnO4) 10 mg/l trong 30 phút, sau đó mỗi gia đình (trong tổng số 34 gia đình dòng Malaysia từ WorldFish Center) hoặc dòng cá (Malaysia, Thái Lan và

20

Israel) được thả riêng rẽ. Trên mỗi bể có bảng tên ghi rõ nguồn gốc (gia đình hoặc dòng), số lượng cá, ngày thả, tình trạng sức khỏe của cá khi thả. Mật độ nuôi cách ly là 70 con/bể. Cho mỗi gia đình (trong tổng số 34 gia đình dòng Malaysia từ WorldFish Center) hoặc dòng cá (Malaysia, Thái Lan và Israel), thu 3 mẫu để kiểm tra bệnh học như nấm và ký sinh trùng. Cho cá ăn thức ăn viên công nghiệp (30% đạm) với lượng cho ăn thỏa mãn, ngày hai lần vào lúc 07:00 và 16:00 giờ. Thường xuyên theo dõi và chăm sóc sức khỏe cá. Thời gian nuôi cách ly là 10 ngày.

Ương nuôi cá nhập bổ sung (Đài Loan, Israel, Malaysia và Thái Lan)

Sau khi nuôi cách ly 10 ngày, cá được chuyển ra ương nuôi. Đối với các gia đình cá Malaysia (trung bình 44 con/gia đình, 34 gia đình), mỗi gia đình được ương nuôi trong các giai kích thước 1,5×2,0×1,0 m đặt trong một ao 1.000 m2. Đối với các dòng cá Đài Loan, Thái Lan (712 con/dòng) và dòng Israel (400 con/dòng), nuôi riêng rẽ từng dòng trong các giai kích thước 3×5×1 m, đặt trong một ao 1.000 m2, độ sâu nước 1,5 m. Cho cá ăn thức ăn viên 30% đạm, 2 lần/ngày, lượng ăn 3 – 5% trọng lượng thân.

Đánh dấu cá nhập bổ sung (Đài Loan, Israel, Malaysia và Thái Lan)

Tiến hành đánh dấu ngay sau khi kết thúc ương nuôi. Cá được đánh dấu từ (Passive Integrated Transponder, PIT tag). Dùng dao mổ rạch một vết nhỏ trên thành bụng của cá, qua đó nhét dấu từ (dài 12 mm, đường kính 2 mm) vào xoang bụng. Đánh dấu toàn bộ cá thể của các dòng.

21

Nuôi tăng trưởng cá nhập bổ sung (Đài Loan, Israel, Malaysia và Thái Lan)

Sau khi đánh dấu, cá giống từ các gia đình (hoặc dòng) được thả nuôi chung trong một ao 2.000 m2, độ sâu nước 1,5 m, mật độ nuôi 3 con/m2. Cho ăn ngày hai lần vào lúc 07:00 giờ sáng và 16:00 giờ chiều, lượng 3 – 5% trọng lượng thân, sử dụng thức ăn viên công nghiệp 24% đạm.

Đối với dòng Israel, cá sau khi đánh dấu được thả nuôi chung với dòng cá G2-Ecuador và cá con của 16 tổ hợp đã được đánh dấu (Phụ lục 2) trong cùng ao diện tích 1.000 m2, độ sâu 1,5 m, chế độ chăm sóc như nuôi tăng trưởng 3 dòng Đài Loan, Thái Lan và Malaysia nhằm đánh giá tăng trưởng.

2.3.1.4. CÔNG VIỆC 1.4: Sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá vật liệu di truyền các dòng cá

Trong năm 2010, thu mẫu vây của bốn dòng cá nhập nội Ecuador, Đài Loan và Thái Lan (60 mẫu/dòng) và Malaysia (53 mẫu). Năm 2012, thu mẫu dòng cá Israel (60 mẫu). Mẫu cá cho thí nghiệm là những cá thể trưởng thành của từng dòng, khỏe mạnh. Thu mẫu một phần vây ngực và bảo quản trong cồn 70. Mẫu sau khi thu được bảo quản trong tủ âm 24C cho đến khi tiến hành tách chiết ADN. Sáu cặp mồi microsatellites sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 17 – 24 bp, bao gồm OM02 (GenBank No:

GU391021) và OM05 (GenBank No: GU391024) (Skagemo và ctv, 2010),

UNH216 (GenBank No: G12367), UNH231 (GenBank No: G12382), UNH172 (GenBank No: G12324) và UNH159 (GenBank No: G12311) (Romana-Eguia và ctv, 2004; Van Oosterhout và ctv, 2004).

22

Bảng 1. Các đoạn mồi microsatellite dùng trong thí nghiệm.

Primer Trình tự

GenBank Accession No.

OM02-F 5’TGTGAATTTGACAACTTCCTTTC3’ GU391021

OM02-R 5’ATCCTTGCAATAAGGTTACAG3’ GU391021

OM05-F 5’GTAAAGTTTGGAACAGAAATGCT3’ GU391024

OM05-R 5’GATCACTTTTGGACAGACTGG3’ GU391024

UNH216-F 5’GGGAAACTAAAGGTGAAATA3’ G12367 UNH216-R 5’TGCAAGGAATATCAGCA3’ G12367 UNH231-F 5’GCCTATTAGTCAAAGCGT3’ G12382 UNH231-R 5’ATTTCTGCAAAAGTTTTCC3’ G12382 UNH172-F 5’AATGCCTTTAAATGCCTTCA3’ G12324 UNH172-R 5’CTTTTATAGTCGCCCTTTGTTA3’ G12324 UNH159-F 5’TTGTTTTAGGAGCTTCTTTTGTC3’ G12311 UNH159-R 5’ATATTCATCTGGATTTGGCTCTAA3’ G12311

DNA được tách chiết nhờ quy trình ‘QUT Salt DNA extraction’ của Miller

và ctv (2007). Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 50-μl với thành phần gồm: 2 μl của 50 ng mẫu ADN vi cá rô phi đỏ; 1 μl 10X dung dịch

đệm (buffer) [500 mM KCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,4)]; 1,5 mM MgCl2;

2,5 mM từng DNTP; 5 pM mỗi mồi; 0,5 đơn vị Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI). Phản ứng PCR được đặt vào trong thiết bị nhân gene BioRad-Thermoblock với quy trình: một chu kỳ (95oC trong 4 phút), 30 chu kỳ [30 giây biến tính (denatirizing ở 95oC, 30 giây nung (annealing) và 30 giây kéo dài (extension) ở 72oC] và kéo dài (extension) trong 10 phút ở 72oC.

23

Hình ảnh điện di được phân tích bằng thiết bị điện di agarose (BioRad). Microsatellite allele được kiểm tra và sửa lỗi bằng phần mềm MICRO- CHECKER phiên bản 2.2.3 (Goudet, 1995). Các chỉ tiêu như cân bằng Hardy-Weinberg, mất cân bằng di truyền (linkage disequilibrium), số lượng allele/locus, dị hợp tử phát hiện (Ho) và mong đợi (He), hệ số cận huyết (FIS) và giá trị khác biệt di truyền (FST) được tính toán bằng phần mềm Arlequin phiên bản 3.1 (Hartl và Clark, 2007). Phong phú allele (allelic richness, Ar) được bằng cách chuẩn hóa biến dị allele về nhóm mẫu có số lượng thấp nhất, sử dụng phần mềm FSTAT phiên bản 2.9.3 (Miller và ctv, 1988).