CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.8. Một số phương pháp phân tích các hóa chất BVTV trong mẫu bụi không khí
khí xung quanh
Việt Nam là một quốc gia nằm trong nhóm nước có nền kinh tế đang phát triển, trong đó nông nghiệp là một trong những ngành kinh tế quan trọng và chủ đạo. Vì vậy, Việc sử dụng ngày càng nhiều HCBVTV góp phần làm ô nhiễm không khí. Các nghiên cứu cũng như tiêu chuẩn, quy chuẩn quy định về dư lượng HCBVTV nói chung trong các môi trường khác nhau như đất, thực phẩm đã được thực hiện và ban hành. Việc phát hiện và định lượng trong môi trường nước và trong bụi không khí thì vẫn còn rất hạn chế. Đặc biệt trong bụi không khí. Dương Thị Hạnh và nhóm tác giả đã thực hiện nghiên cứu: Sự xuất hiện và đánh giá rủi ro của thuốc diệt cỏ, diệt nấm trong hạt khí quyển ở Hà Nội, Việt Nam (tại Nhật Bản) cho thấy: ~ 200 chất diệt cỏ và chất diệt nấm cực không bay hơi hoặc bay hơi thấp trong các mẫu APM được thu thập từ một
23
khu vực đông dân cư và mật độ giao thông cao ở Hà Nội trong mùa khô và mùa mưa đã được phát hiện. Kết quả tác giả cung cấp tính mới và dữ liệu quan trọng, cần thiết cho sự đánh giá mức độ ô nhiễm của không khí hiệu quả để từ đó có biện pháp đối phó ở Việt Nam. Thông tin đánh giá mức độ ô nhiễm và các rủi ro liên quan đến chất diệt nấm còn đang rất thiếu hụt.
Hiện tại, chỉ có hai nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký khí - khối lượng phép đo phổ (GC-MS) để giám sát các hóa chất này trong các hạt vật chất khí quyển tại Hà Nội; tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ nhắm vào các hợp chất hữu cơ bán dễ bay hơi (Anh và cộng sự, 2019; Dương và cộng sự, 2019). Với sự tiến bộ nhanh chóng của các phương pháp LC-MS đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc điều tra các hóa chất phân cực mới nổi trong ô nhiễm khí quyển (Brackvà cộng sự, 2015). LC-MS đã được sử dụng để phân tích tất cả các loại thuốc trừ sâu trong môi trường (Ferrer và Thurman, 2007). Ví dụ, giám sát phản ứng LCselected (SRM) -MS/MS đã được sử dụng để định lượng hơn 100 loại thuốc trừ sâu trong APM ở Valencia, Tây Ban Nha (Yusà et al., 2014).
Gần đây, LC-MS/MS kết hợp với QTOF đã được phát triển để xác định một số lượng lớn hơn các hợp chất có khả năng xác định và định lượng cao; tuy nhiên, phương pháp này cho thấy khả năng phát hiện sai thường xuyên (Chau et al., 2017). Để vượt qua những hạn chế này, Kadokami và Ueno (2019) đã cải tiến phương pháp LC-QTOF-MS bằng cách sử dụng SWATH, có thể định lượng hiệu quả 28 và 29 thuốc trừ sâu trong nước thải và sông, với độ chọn lọc cao và giới hạn phát hiện thấp (Kadokami và Ueno, 2019; Lee và cộng sự, 2020). Đến nay, phương pháp LC-QTOF-MS-SWATH đã được sử dụng thành công để sàng lọc thuốc diệt nấm trong APM được thu thập từ các vị trí lấy mẫu.
Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng phương pháp LC-QTOF- MS-SWATH để xác định và định lượng thuốc diệt nấm phân cực không bay hơi hoặc bay hơi thấp trong các mẫu APM được thu thập từ một khu vực đông dân cư và mật độ giao thông cao ở Hà Nội trong mùa khô và mùa mưa. Hơn nữa, chúng tôi đã làm rõ sự xuất hiện của các loại thuốc diệt nấm được phát hiện và định lượng chúng.
24
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Dung môi: Tất cả các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm n- hexan (Hex), Axeton (Ace) và etyl axetat (EtAc) đều của Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan) và đều thuộc loại tinh khiết phân tích. Nước tinh khiết (cấp LC-MS) bằng Elga Purelab Chorus 1 (Veolia Water, Tokyo, Japan). Bộ lọc ống tiêm Millex-LG (kích thước lỗ 0,2 µm, Ø4 mm) của Merk Millipore (Darmstadt, Gemany). Methanol (độ tinh khiết cấp LC-MS) và amino axetat (CAS:631-61-8; nồng độ 1 mol/L, độ tinh khiết cấp HPLC) được sản xuất lần lượt từ Kanto Chemical và Fujifilm Wako Pure Chemical corporation (Osaka, Japan).
- Các hóa chất chuẩn (6 chất): Gồm carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin của Restek Japan và Kanto Chemical (Tokyo, Japan). Các chất chuẩn được pha loãng với methanol để chuẩn bị các dung dịch hỗn hợp hoạt động và sau đó được bảo quản ở -20°C trong tủ đông.
- Hỗn hợp nội chuẩn (IS) và chuẩn đồng hành: Được mua từ Kanto Chemical và Hayashi Pure Chemical (Osaka, Japan).
Nội chuẩn (6 chất): methamidophos-d6, methomyl-d3, carbendazim-d4, pirimicarb-d6, imazalil-d5 và etofenprox-d5.
Chuẩn đồng hành (5 chất): sulfadimethoxine-d6, diflubenzuron-d4, sulfamethoxazole-d4, carbofuran-d3 và carbaryl-d7.
- Pha động:Kênh A: Nước + 5 mM amoni fomat + 0,1% formic axit Kênh B: Methanol + 5 mM amoni fomat
- Màng lọc: Sợi thạch anh (QR-100; 203 x 254 mm) của hãng Advantec. - Dụng cụ thủy tinh: Được làm sạch bằng cách ngâm nước tẩy rửa axit cromic (bao gồm 5% Kali đicromat trong dung dịch H2SO4). Sau tráng rửa dụng
25
cụ cẩn thận bằng nước khử ion và axeton, dụng cụ thủy tinh được sấy khô ở 250°C trong 5 giờ trước khi mang ra sử dụng.
Bảng 2.1: Các chất diệt nấm, nội chuẩn và chất chuẩn đồng hành
TT Hợp chất Công thức CAS 1 Các chất diệt nấm Carbendazim C9H9N3O2 10605-21-7 2 Difenoconazole Isomer 1&2 C19H17Cl2N3O3 119446-68-3 3 Hexaconazole C14H17Cl2N3O 79983-71-4 4 Thiophanate-methyl C12H14N4O4S2 23564-05-8 5 Trifloxystrobin C20H19F3N2O4 141517-21-7 6 Azoxystrobin C22H17N3O5 131860-33-8 IS-1 Các chất nội chuẩn Methamidophos-d6 C2H2D6NO2PS 1219799-41-3 IS-2 Methomyl-d3 C5H7D3N2O2S 1398109-07-3 IS-3 Carbendazim-d4 C9H5D4N3O2 291765-95-2 IS-4 Pirimicarb-d6 C11H12D6N4O2 1015854-66-6 IS-5 Imazalil-d5 C14H9D5Cl2N2O 1398065-91-2 IS-6 Etofenprox-d5 C25H23D5O3 1705649-55-3 Sur-1 Chất chuẩn đồng hành Sulfadimethoxine-d6 C12H8D6N4O4S 730668-02-7 Sur-2 Diflubenzuron-d4 C14H5D4ClF2N2O2 1219795-45-5 Sur-3 Sulfamethoxazole-d4 C10H7D4N3O3S 1020719-86-1 Sur-4 Carbofuran-d3 C12H12D3NO3 1007459-98-4 Sur-5 Carbaryl-d7 C12H4D7NO2 362049-56-7 2.1.2. Thiết bị
- Màng lọc sợi thạch anh (QR-100; 203 x 254 mm) của hãng Advantec. - Thiết bị lấy mẫu khí và bụi tại hiện trường: Thể tích lớn (121H KIMOTO)
26 - Bể siêu âm (SUPER RK510)
- Thiết bị ly tâm (Hettich Rotina 420R, Đức) - Cân phân tích (±0.0001 mg)
- Tủ sấy (50o
C - 300oC) (Sellab, Mỹ)
- Tủ lạnh sâu (Sanyo Biomedical MDF-U333)
- Thiết bị cất nước tinh khiết (Elix 3 UV Water Purification System (120 V/60 Hz, Millipore)
- Các vial thủy tinh nâu đựng mẫu, phải có nắp bao bởi Teflon.
2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Bụi không khí tại khu vực dân cư tại Hà Nội và các hoá chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin).
- Phạm vi nghiên cứu: Quận Nam Từ Liêm- Hà Nội
- Thời gian lấy mẫu: Từ tháng 6/2020 – tháng 10/2020.
- Nội dung thực hiện qua các bước:
+ Bước 1: Khảo sát quy trình phân tích xác định hàm lượng hoá chất diệt nấm trong mẫu bụi không khí trên thiết bị LC-MS.
+ Bước 2: Lấy mẫu tại các vị trí khảo sát ở thành phố Hà Nội.
+ Bước 3: Tiến hành phân tích mẫu thực tế sử dụng kỹ thuật chiết tách và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích xác định hàm lượng hoá chất diệt nấm
+ Bước 4: Đánh giá rủi ro, tác động của hoá chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin) trong bụi không khí xung quanh đến sức khỏe con người.
27
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp thu thập số liệu
Phương pháp thu thập, kế thừa số liệu, dữ liệu từ các tài liệu trong nước và quốc tế liên quan đến hiện trạng hoá chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin) trong không khí và bụi không khí. Tham khảo các phương pháp thu thập mẫu, chiết tách, phân tích mẫu, tổng hợp số liệu điều tra, khảo sát và phân tích kết quả. Các phương pháp đánh giá độc tính và truy tìm nguồn ô nhiễm.
2.2.2.2. Phương pháp điều tra thực địa
Phương pháp nghiên cứu thực địa nhằm khảo sát và lựa chọn được vị trí lấy mẫu phù hợp (đảm bảo các yêu cầu về mật độ dân cư, loại hình sản xuất, kinh doanh trong khu vực...).
2.2.2.3. Phương pháp phân tích trên thiết bị LC-QTOF-MS-SWATH
Các bước thực hiện khi phân tích trên thiết bị LC-QTOF-MS-SWATH Bước 1: Chuẩn bị pha động
- Pha động A: 5mM CH3COONH4 trong H2O - Pha động B: 5 mM CH3COONH4 in CH3OH Bước 2: Chuẩn bị chất chuẩn
- Quy trình chuẩn bị chuẩn (standards) theo quy trình của từng ứng dụng. Bước 3: Chuẩn bị hệ thống LC
- Bật các thiết bị của LC (Autosampler, pump 1, pump 2, oven, CBM). - Chuẩn bị pha động, dung dịch rửa cho kim tiêm, dung dịch rửa pump. - Điền đầy đủ đường ống bằng pha động mới bằng cách xoay vavle của pump 1 và pump 2 trên pump (xoay núm 1 vòng nhấn purge. Có thể nhấn thêm purge 1 lần nữa nếu thấy 1 lần purge chưa đủ). Sau khi purge xong, khóa chặt vavle lại.
28 - Purge đường nước rửa cho autosampler. - Lắp cột phân tích vào lò cột (nếu chưa lắp).
- Nếu cột mới, cần phải cân bằng cột trong thời gian từ 2 - 3 giờ với tốc độ dòng khoảng 0,2 - 0,3 mL/ min của MeOH : H2O (tỷ lệ 60: 40) (khi cân bằng cột, đầu ra của cột tháo khỏi detector MS, cho vào một lọ thải, tránh làm bẩn detector).
- Nếu cột cũ đang sử dụng, cân bằng cột trong thời gian 30 min với pha động như trên (dung môi cho pha động lựa chọn tùy thuộc loại mẫu phân tích).
- Kiểm tra mực nước thải trong chai thải, đổ đi nếu đầy . - Mở máy tính .
- Thiết bị LC sẵn sàng cho quá trình phân tích. Bước 4: Tạo phương pháp phân tích/Acquisition. Bước 5: Xem lại dữ liệu/ Data review và xử lý số liệu.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Khảo sát phương pháp phân tích imidacloprid và thiamethoxam trên
LC-QTOF-MS-SWATH
2.3.1.1. Điều kiện phân tích các chất diệt nấm trên LC-QTOF-MS-SWATH
Các hợp chất các chất diệt nấm sẽ được phân tích trên thiết bị LC-QTOF- MS-SWATH. Do đó khảo sát các điều kiện đo trên thiết bị này để xây dựng phương pháp xác định chúng trên thiết bị LC-QTOF-MS-SWATH (Sciex X500R QTOF system). Dựa trên cơ sở tham khảo nghiên cứu, kế thừa điều kiện phân tích công trình nghiên cứu của các tác giả Kiwao Kadokami, and Daisuke Ueno. (Phân tích 484 chất lượng hữu cơ trong nước môi trường bằng sự kết hợp của chiết pha rắn và phương pháp đo phổ khối lượng thời gian bay tứ cực), và xác định các chất ô nhiễm hữu cơ trong bụi không khí trên thiết bị LC-QTOF- MS của Kadokami và các cộng sự. Nghiên cứu này có một số thay đổi nhỏ, đã chọn ra điều kiện như sau: thiết bị LC-QTOF-MS (Sciex X500R QTOF system), cột GL Science ODS-4 HP (chiều dài 150mm, đường kính trong 2,1mm và bề
29
dày lớp pha tĩnh 3µm); pha động (pha động A: 5mM CH3COONH4 trong H2O, pha động B: 5 mM CH3COONH4 in CH3OH); thể tích tiêm mẫu là 2 µL; nhiệt độ cổng bơm 40°C, tốc độ dòng khí 0.3 mL min-1
, nguồn ion TurbolonSpray, chế độ ion hoá ESI (+), chế độ đo Swath, TOF-MS (khoảng scan)50 - 1000 Da, 0.1s, TOF MS/MS50 - 1000 Da, 22 ranges, 0.07s each. Khí Nitơ được sử dụng làm khí mang.
- Các điều kiện được nghiên cứu khảo sát: pha động, thời gian chạy, năng lượng bắn phá.
- Các mẫu dùng để khảo sát: Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin) (50 ppb).
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: dung môi MeOH dùng làm mẫu trắng, pha dung dịch các chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin, azoxystrobin) gốc (500 mg/L) (A) bằng dung môi MeOH, bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở -200
C.
- Dung dịch chuẩn trung gian (1000 µg/L) (B): hút chính xác 0,2 ml dung dịch chuẩn gốc (A) vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH.
- Dung dịch chuẩn trung gian (10 µg/L) (C): hút chính xác 1 ml dung dịch (B) vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH.
- Dung dịch chuẩn làm việc (500 ng/L): hút chính xác 2,5 ml dung dịch (C) vào bình định mức 50 mL, định mức bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào thiết bị đo.
2.3.1.3 Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn (500 ng/L). Độ lệch chuẩn tương đối của kết quả đo các chất diệt nấm giữa các lần tiêm lặp lại ≤ 2,0 %. Nếu kết quả cao hơn thì tiến hành
30
2.3.1.4. Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn có hàm lượng các chất diệt nấm (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin) thấp và tiến hành xác định tỷ lệ S/N. Giới hạn phát hiện (IDL) được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn các chất diệt nấm đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền (S/N).
Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ) của các chất diệt nấm sẽ được xác định dựa trên mối quan hệ giữa giới hạn phát hiện thiết bị (IDL) và giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ) theo tỷ lệ (IDL: MDL: LOQ = 1: 4: 10) (SMEWW 1030C, 2017).
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đảm bảo chất lượng của phương pháp
Để kiểm soát chất lượng của quy trình phân tích mẫu trên thiết bị LC- QTOF-MS-SWATH, quy trình kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng (QC/QA) thường được thực hiện. Vì vậy, trong nghiên cứu này, QA/QC được tiến hành dựa trên hướng dẫn của SMEWW 1020A và 1020B (2017), bao gồm: quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP), phân tích thêm chuẩn đồng hành vào mẫu thử nghiệm, phân tích các mẫu lặp, xác nhận đường chuẩn và giới hạn phát hiện. Để xác định khả năng gây nhiễu và nhiễm bẩn trong quá trình phân tích và nhiễm bẩn từ phòng thí nghiệm, mẫu trắng được sử dụng để phân tích đồng thời với mỗi lô 8 mẫu. Nồng độ thực của các chất phát hiện được xác định sau khi đã trừ đi giá trị trung bình của mẫu trắng, mẫu lặp.
a) Dựng đường chuẩn
- Dựng đường chuẩn của hỗn hợp 6 chất chuẩn (carbendazim, difenoconazole isomer 1&2, hexaconazole, thiophanate-methyl, trifloxystrobin và azoxystrobin) với khoảng nồng độ: từ 10 ppb – 1000ppb (0,1 ppb; 0,5ppb; 1 ppb; 2 ppb; 4 ppb; 10 ppb; 20 ppb; 40 ppb; 100 ppb; 200 ppb; 400ppb 1000 ppb) trong MeOH.
31
Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: y = ax + b
Trong đó: a: giá trị slope (độ dốc)
b: giá trị intercept (hệ số chặn)
Và hệ số tương quan R: Rx,y = ∑𝑖=1𝑛 (𝑥𝑖−𝑋���)(𝑦𝑖−𝑌� )
�∑ (𝑥𝑖−𝑋� )2∑𝑛 (𝑦𝑖−𝑌�)2 𝑖=0
𝑛 𝑖=0
(2.1) - Yêu cầu độ tuyến tính của đường chuẩn: R2≥ 0,995
- Kiểm tra lại một điểm giữa của dãy chuẩn, yêu cầu sai số cho phép ≤ 15%
- Nếu không đạt điều kiện trên, tiến hành kiểm tra và dựng lại đường chuẩn.
b) Phân tích mẫu trắng
- Tiến hành phân tích mẫu trắng vào mỗi lần phân tích mẫu thử.
- Nồng độ của chỉ tiêu phân tích tìm thấy trong mẫu trắng phải nhỏ hơn giới hạn phát hiện của phương pháp.
- Nếu nồng độ của mẫu trắng cao, thì phải kiểm tra mẫu trắng và tiến hành phân tích lại.
c) Đo lặp lại
- Mẫu được đo lặp lại ít nhất hai lần trong mỗi lần phân tích. - Độ lệch chuẩn của phép đo RSD tối đa 30 %
- Nếu độ lệch chuẩn của các giá trị thu được nằm ngoài giới hạn trên, thì phải tiến hành phân tích lại.
d) Mẫu kiểm soát của phòng thí nghiệm
- Mẫu kiểm soát được tiến hành phân tích theo quy trình vận hành chuẩn. - Cứ mỗi 10 mẫu, thì phân tích mẫu kiểm soát, hoặc trước khi kết thúc đo
32 mẫu thì đo mẫu kiểm soát.
- Độ thu hồi của mẫu kiểm soát tối đa là 60-125% - Nếu không đạt, thì tiến hành kiểm tra và phân tích lại