Thiết kế và khám phá thuốc dựa trên mục tiêu phân tử hiện đang thu hút sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu hóa dược trong việc khám phá và phát triển thuốc chống ung thư trên toàn thế giới [122]. Nhiều mục tiêu phân tử cho thuốc chống ung thư đã được xác định, bao gồm enzym histondeacetylase (HDAC) hiện được coi là mục tiêu hấp dẫn đối với thiết kế thuốc chống ung thư [123, 124]. HDAC là các enzym xúc tác việc loại bỏ các nhóm acetyl khỏi lysine trong các đuôi histone và điều này dẫn đến sự ngưng tụ chất nhiễm sắc và ức chế phiên mã. HDAC cũng đã được công nhận tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen và chất nhiễm sắc cấu trúc và có một vai trò quan trọng trong sự tiến triển của chu kỳ tế bào và quá trình gây ung thư [123, 124]. Cho đến nay, tổng số 18 HDAC của loài động vật có vú. Các enzym HDAC đã được xác định và phân loại thành bốn các lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và chức năng của chúng [125]. Nghiên cứu sâu và rộng cả in vitro và in vivo các mô hình liên quan đến tác dụng ức chế HDACs đã chỉ ra rằng tác dụng ức chế HDAC dẫn đến sự biệt hóa tế bào, quá trình chết tế bào theo chương trình và bắt giữ chu kỳ tế bào trong một số dòng tế bào ung thư [126–134]. Chất ức chế HDAC do đó trở thành một nhóm tác nhân trị liệu đầy hứa hẹn, tác dụng gây ra sự phân hóa tế bào khối u, biệt hóa và apoptosis trong các khối u ác tính thể rắn và thể huyết học khác nhau [131-134,135,136]. Trên thực tế, nhiều chất ức chế HDAC mạnh đã được phát triển bao gồm SAHA (axit suberoylanilide hydroxamic, Vorinostat), PXD-01 (Belinostat), LBH-589 (Panobinostat), MS- 27-
99
527 (Entinostat), và romidepsin (Hình 24) [137,138]. Gần đây hơn, hai chất ức chế HDAC bao gồm SAHA (tên thương mại, Zolinza) và romidepsin (tên thương mại, Istodax) (Hình 24) đã được FDA chấp thuận vào năm 2006 và 2009 để điều trị ung thư hạch tế bào T ở da.
Hình 28. Một số chất ức chế HDAC
Xem xét đặc điểm cấu trúc và tác dụng dược lý của chất ức chế HDAC được đặc trưng bởi vùng nhận dạng bề mặt (nhóm CAP), một linker thường là (kỵ nước) và nhóm liên kết kẽm (ZBG) [139], chúng tôi hướng tới việc khám phá gốc artemisinin như một nhóm CAP mới và các liên kết (linker) khác nhau như một sự thay thế của các khung giống SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid, Vorinostat) với hy vọng mang lại về các chất lai mới có thể có cơ chế kép của cả cầu endoperoxit và nhóm axit hydroxamic (Hình 25).
100
Quá trình tổng hợp các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm hydroxamic axit (67a-g) được minh họa trong sơ đồ 20. Các chất trung gian 10β-azidoartemisinin và 10β-aminoartemisinin (64) và các axit trung gian 65a-g được tổng hợp tương tự như ở sơ đồ 18. Phản ứng tiếp theo của 4 với O- (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) hydroxylamin (H2NO-THP) trong diclometan với sự có mặt của EDC.HCl, DMAP để tạo ra các amit tương ứng với hiệu suất cao. Nhóm bảo vệ THP của các amit này được loại bỏ dễ dàng bằng cách sử dụng benzoyl clorua cho 67a-g với hiệu suất cao (Sơ đồ 20).
Tất cả các hợp chất được đặc trưng về cấu trúc dựa trên phương pháp phổ: IR, NMR và ESI-HRMS. Chất 67c làm ví dụ chứng minh cấu trúc. Phổ 1H NMR cho thấy sự xuất hiện của đầy đủ các proton trong cấu trúc phân tử trong đó 3 tín hiệu đơn tù, có cường độ yếu ở trường thấp nhất được quy cho nhóm NH hydroxamic, NH amit và OH hydroxamic ở δ 10,41; 8,73 và 8,63 ppm. Hai nhóm CH3 ở mạch nhánh cộng hưởng ở trường cao dưới dạng pic đơn cường độ mạnh ở δ 0,99 ppm. Tín hiệu đơn mạnh ở 5,39 ppm được quy cho proton H-12 của khung artemisini. Tín hiệu triplet ở 5,08 (J = 10,0 Hz) là của proton H-10. Các tín hiệu khác của khung artemisinin xuấ hiện ở trường cao và không có sự thay đổi nhiều. Phổ 13C NMR của cho thấy có sự xuất hiện của 21 carbon trong phân tử, trong dó ở trường thấp nhất là tín hiệu của 2 carbon amit ở δ 171,0 và 167,7 ppm. 3 carbon đặc trưng của khung artemisinin dễ dàng thấy được ở δ 103,3 (C-12); 90,6 (C-10) và 80,1 (C-12a). Ngoài ra, tín hiệu ở 25,6 ppm của 2 carbon tương đương cho thấy sự có mặt của mạch nhánh hydroxamic của chất 67c. Cuối cùng cấu trúc của 67c được khẳng định thêm bằng phổ ESI-HRMS ở 441.26006 [M+H]+.
101
Hình 30. Phổ 1H NMR của 67c
102
Hình 32. Phổ giãn 1H NMR của 67c
103
Hình 34. Phổ ESI-HRMS của chất 67c 4.6. Hoạt tính ức chế HDAC và độc tế bào của các 67a-g
Bảng 5. Hoạt tính ức chế HDAC và gây độc tế bào của chất 67a-g
TT Chất linker HDAC(IC50, µM) IC50 b , µM)/Cell Linec HepG2 MCF-7 HL-60 1 67a -(CH2)2- 57.03 35.60 27.58 16.10 2 67b -(CH2)3- >200 >200 181.11 52.52 3 67c -(CH2)C(CH3)2CH2- 153.72 148.31 154.38 84.83 4 67d -CH=CH- 137.47 176.46 146.71 33.78
104
5 67e >200 174.26 153.47 52.82
6 67f -(CH2)4- >200 164.22 136.36 32.37
7 67g -(CH2)6- 64.55 5.5 5.77 2.81
SAHAd 1.32 1.17 7.2 0.68
Như được trình bày trong bảng 5, tất cả các hợp chất 67a-g thể hiện tác dụng ức chế trên ba dòng tế bào ung thư ở người được thử nghiệm với giá trị IC50 dao động từ 2.81 đến >200 µM. Nói chung, các hợp chất cho thấy độc tính tế bào cao hơn trên dòng tế bào ung thư máu (HL-60), so với gan (Hep-G2) và dòng tế bào vú (MCF-7). Hợp chất 67g, với một Cầu 6C, tương tự như SAHA, cho thấy tác dụng gây độc mạnh nhất với giá trị IC50 là 5,5, 5,77 và 2,81 µM so với HepG2, MCF-7, và các dòng tế bào HL-60. Hợp chất 67a chứa mạch cacbon ngắn nhất vẫn thể hiện khá tốt độc tính tế bào chống lại ba dòng tế bào được thử nghiệm với giá trị IC50 của Lần lượt là 35,6; 27,58 và 16,1 µM. Có sự giảm đáng kể độc tính tế bào đối với các hợp chất 67b và 67c. Hai hợp chất này có cầu nối dài hơn một nhóm CH2 cho thấy độc tính tế bào giảm đi gần 3 lần so với hợp chất 67a trên HL-60 (giá trị IC50 là 52,52 µM so với 16,1 µM). Với các dòng tế bào HepG2 và MCF-7, độc tính tế bào của chất này thậm chí còn giảm hơn nữa. Hợp chất 67d với cầu nối đôi chỉ thể hiện độc tính tế bào yếu trên HepG2 và MCF-7, nhưng tác dụng gây độc tế bào cao hơn đáng kể trên dòng tế bào HL-60 với giá trị IC50 là 13,38 µM. Ngoài ra, hợp chất 67e
có cầu nối phenyl, chỉ thể hiện độc tính tế bào vừa phải trên HL-60 với giá trị IC50 là 52,82 µM. Với các dòng tế bào HepG2 và MCF-7, hợp chất này thể hiện hoạt tính độc tế bào yếu. Hợp chất 67f với cầu nối 4C được thể hiện độc tính tế bào tương tự như của hợp chất 67d ở cả ba dòng tế bào.
Để đánh giá mối tương quan giữa độc tính tế bào và tác dụng ức chế HDAC, các hợp chất 67a-g được sàng lọc tiếp theo về tác dụng ức chế enzym HDAC tổng và kết quả là được tóm tắt trong Bảng 5. Dữ liệu chỉ ra rõ ràng rằng tác dụng ức chế HDAC của các hợp chất này vẫn thấp hơn nhiều so với của SAHA và chỉ có hai hợp chất 67a và 67g cho thấy hiệu quả ức chế HDAC tốt nhất với giá trị IC50 tương ứng
105
là 57,03 và 64,55 µM. Mặc dù tác dụng ức chế HDAC của các các hợp chất này vẫn rất yếu, nhưng dường như tồn tại một mối tương quan tương đối giữa độc tính tế bào và khả năng của các hợp chất này ức chế enzym HDAC đã được khử nghiệm. Trong số nhiều yếu tố giống thuốc trong quy tắc Lipinski [140], độ hòa tan trong nước thấp của các hợp chất này (được biểu thị bằng các giá trị logP), ảnh hưởng đến sự thâm nhập qua màng tế bào có thể giải thích được cho sự chênh lệch tác dụng ức chế enzym và độc tính tế bào. Thật bất ngờ, hợp chất 67a thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn so với hợp chất 67g, nhưng lại thể hiện độc tính tế bào kém hơn với 3 dòng tế bào đã thử nghiệm. Trong trường hợp này, dường như độ hòa tan trong dầu cao của hợp chất 67g (logP 3.87) có tác dụng có lợi hơn cho hoạt tính gây độc tế bào so với hợp chất 67a (logP 1.85). Các kết quả thử nghiệm này cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh của hai hợp chất, đặc biệt là 67g có thể được đóng góp bởi phần khung artemisinin, vùng liên kết (chuỗi liên kết 6 cacbon) và nhóm liên kết kẽm (ZBG).
Để có thể hiểu thêm về sự tương tác của các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm axit hydroxamic với HDAC, nghiên cứu mô phỏng docking vùng hoạt động của HDAC thực hiện với hai hợp chất 67a và 67g. Trong nghiên cứu này, chúng tôi quyết định chọn cấu trúc của HDAC2 để thí nghiệm. Docking đối chứng với SAHA của HDAC2 được thực hiện sử dụng chương trình Autodock Vina [141].
Bảng 6: Ái lực liên kết của 67a và 67g với HDAC2 Chất Công thức
phân tử
Trọng lượng phân tử
LogPa Ái lực liên kết (Kcal/mol) 67a C19H30N2O7 398.45 1.85 7.1 67g C23H38N2O7 454.56 3.87 7.0 SAHAb C14H20N2O3 264.32 1.44 7.4 a Tính toán bằng phần mềm Molinspiration. bSAHA, axit suberoylanilid hydroxamic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả docking (Hình 31) cho thấy hai hợp chất được chọn đều nằm trong vùng hoạt động với ái lực liên kết từ -7.1 đến -7.0 kcal/mol, thấp hơn một chút so với SAHA (-7.4 kcal / mol) (Bảng 5). Trong nghiên cứu này, cả hai hợp chất đều có
106
kiểu liên kết và giá trị ái lực tương tự nhau. Các hợp chất tương tác với ion Zn (hình cầu màu xám) theo cách tương tự như SAHA, và nửa hydroxylamine được định hướng xung quanh nguyên tử kẽm và His145. Ngoài ra, ion Zn được phối trí bởi ba phối tử của HDAC2, bao gồm His183, Asp 269 và Asp 181 (Hình 26). Phần đầu cồng kềnh của các phân tử hướng ra phía ngoài trong khi các chuỗi hydroxamic liên kết với bộ khung artemisinin xen kẽ giữa Phe 210 và Phe 155 của HDAC2. Có thể thấy có rất ít sai khác về ái lực và cách mà nhóm artemisinin liên kết với bề mặt của hốc liên kết phối tử của protein HDAC2. Điều này có thể có giúp giải thích được về tác dụng ức chế enzym HDAC tốt hơn của 67a so với 67g.
Hình 35. Hình ảnh liên kết của SAHA và liên kết mô phỏng của các hợp chất 67a và 67g với HDAC2. SAHA được thể hiện có màu cam.
Các hợp chất 67a và 67g được thể hiện với carbon có màu lục lam và xanh lục; các nguyên tử nitơ và oxy có màu tương ứng là xanh lam đậm và đỏ. Đám mây màu trắng đại diện cho bề mặt của khoang liên kết phối tử của protein HDAC2. Ion Zn2+ có dạng hình cầu màu xám.
107
KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ thời gian thực hiện của đề tài, luận án đã đạt được những kết quả mới sau đây:
1. Đã tổng hợp được 19 hợp chất mới là các dẫn xuất triazole artemisinin sử dụng phản ứng Click. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc với các dòng tế bào MCF-7, LU-1, HL-60 và P388 cho thấy hầu hết các dẫn xuất triazole đều thể hiện hoạt tính gây độc với 3 dòng tế bào đã thử, trong đó hợp chất 61g thể tác dụng gây độc mạnh nhất với dòng tế bào HL-60 với giá trị IC50: 2,5 µM. 2. Đã tổng hợp 7 dẫn xuất C10-amino dimer artemisinin được tổng hợp và đánh
giá tác dụng gây độc với 3 dòng tế bào ung thư: HepG2, MCF-7 và HL-60. Kết quả cho thấy chất 66d thể hiện hoạt tính gây độc với 3 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 tương ứng 7,86; 7,46 and 2,04 µM
3. Lần đầu tiên các dẫn xuất mới của artemisinin chứa nhóm axit hydroxamic được thiết kế, tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC và tác dụng gây độc với 3 dòng tế bào HepG2, MCF-7 và HL-60. Kết quả đánh giá sinh học cho thấy hợp chất 67g thể hiện hoạt tính gây độc tiềm năng với các dòng tế bào đã thử với giá trị IC50 tương ứng: 5,5; 5,77 và 2,81 µM. Nghiên cứu docking với HDAC cho thấy, chất 67g thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở IC50 64,55 µM. Nghiên cứu này cũng cho thấy hầu hết các dẫn chất của artemisinin chứa nhóm axit hydroxamic có xu hướng độc với dòng tế bào HL-60 hơn hai dòng HepG2 và MCF-7.
108
NHỮNG CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐÃ CÔNG BỐ
1. Le Huy Binh, Nguyen Thi Thuy Van, Vu Tuan Kien, Nguyen Thi Thuy My, Luu Van Chinh,Nguyen Thi Nga, Hoang Xuan Tien, Do Thi Thao, Tran Khac Vu. Synthesis and in vitro cytotoxic evaluation of new triazole derivatives based on artemisinin via click chemistry. Med. Chem. Res. 2016, 25 (4), 738-750.
2. Vu Thi Ha, Vu Tuan Kien, Le Huy Binh, Vu Dinh Tien, Nguyen Thi Thuy My, Nguyen Hai Nam, Michael Baltas, Hyunggu Hahn, Byung Woo Han, Do Thi Thao, Tran Khac Vu. Design, synthesis and biological evaluation of novel hydroxamic acids bearing artemisinin skeleton. Bioorganic Chemistry, 2016, 66, 63–71.
3. Vu Tuan Kien, Le Huy Binh, Phan Hai Phong, Doan Thi Hien, Nguyen Thi Thuy My, Nguyen Hai Nam, Do Thi Thao, Michael Baltas and Tran Khac Vu. Novel Artemisinin-Derived Dimers: Synthesis and Evaluation of Anticancer Activities.
109
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2004.
2. D. L. Klayman, “Qinghaosu (artemisinin): An antimalarial drug from China,” Science., 1985, 228, 1049–1055.
3. J. Li and B. Zhou, “Biological actions of artemisinin: Insights from medicinal chemistry studies,” Molecules., 2010, 15 (3)1378–1397.
4. Karin Rath, Katja Taxis, Gitta Walz, Christoph H. Gleiter, Shu-Ming Li and Lutz Heide. Pharmacokinetic Study of Artemisinin after oral Intake of a Traditional Preparation of Artemisia Annua L. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene., 2004, 70 (2), 128-132.
5. Y. Zhang et al., “Ultrasonic assisted extraction of artemisinin from: Artemisia Annua L. using monoether-based solvents,” Green Chem.,
2018, 20 (3) 713–723.
6. Marcel Kohler, Werner Haerdi, Philippe Christen, Jean -Luc Veuthey. Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua L. using supercritical carbon dioxide. Journal of Chromatography A.,
1997, 785, 353-360.
7. P. T. Hiển and N. V. Hân, “Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá Thanh cao hoa vàng bằng carbon dioxyd siêu tới hạn” Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, 2015, 5–7.
8. J. S. Yadav, B. Thirupathaiah, and P. Srihari, “A concise stereoselective total synthesis of (+)-artemisinin,” Tetrahedron., 2010, 11, 2005–2009.
9. Brown, G. D. The biosynthesis of artemisinin (Qinghaosu) and the phytochemistry of Artemisia annua L. (Qinghao). Molecules.,2010,15, 7603– 7698.
10. Hanahan, D. & Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell., 2000, 100, 57– 70. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11. National Cancer Registry Ireland. Cancer in Ireland 1994-2014: Annual Report of the National Cancer Registry (2016).
110
12. National Cancer Registry Ireland. Cancer projections for Ireland 2015- 2040. (2014).
13. Silvenberg, E. & Lubera, J. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin. 1987, 37, 2–19.
14. Ferlay, J. et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J. Cancer., 2015, 136, E359– E386.
15. Fisher, B. et al. Postoperative adjuvant chemotherapy or radiation therapy for rectal cancer: results from NSABP protocol R-01. J. Natl. Cancer Inst. 1988,
80,21–29.
16. Corrie, P. G. Cytotoxic chemotherapy: clinical aspects. Medicine (Baltimore). 2008, 36,24–28.
17. Hayden, E. C. Cutting off cancer’s supply lines. Nature., 2009, 458, 686– 687.
18. Subotic, S., Wyler, S. & Bachmann, A. Surgical Treatment of Localised Renal Cancer. Eur. Urol. Suppl., 2012, 11,60–65.
19. Sawyers, C. Targeted cancer therapy. Nature., 2004, 432,294–297.
20. Lauren, P. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, targets, and therapeutics. OxfordUniversity Press (2012).
21. National Cancer Institute. Surgery for Cancer. Available at: https://www.cancer.gov/aboutcancer/treatment/types/surgery#WHS.
(Accessed: 10th April 2017) 154.
22. World Health Organisation. Latest world cancer statistics Global cancer burden rises to 14.1 million new cases in 2012: Marked increase in breast cancers must be addressed. Press release 223 (2013).
23. Bailar, J. C. & Gornik, H. L. Cancer undefeated. N. Engl. J. Med., 1997,336,