2.3.2.1. Phương pháp chiết xuất gián đoạn
Phương pháp ngâm: Phương pháp ngâm là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa.
Tiến hành: Sau khi chuẩn bị mẫu, người ta đổ dung môi cho ngập mẫu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng loại mẫu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa lại phần bã bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên.
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản và rẻ tiền.
Nhược điểm: Nhược điểm chung của phương pháp ngâm là năng suất
thấp, thao tác thủ công. Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong mẫu chiết, nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.
Phương pháp ngấm kiệt
Tiến hành: Sau khi chuẩn bị mẫu, ngâm mẫu vào dung môi trong bình ngấm kiệt. Sau một khoảng thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp mẫu chiết nằm yên (không được khuấy trộn). Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt mẫu chiết khoảng 3-4cm.
Ưu điểm: Mẫu chiết được chiết kiệt. Tiết kiệm được dung môi (tái ngấm kiệt).
năng suất thấp, lao động thủ công. Cách tiến hành phức tạp hơn so với phương pháp ngâm. Tốn dung môi hơn so với ngấm kiệt đơn giản.
2.3.2.2. Phương pháp chiết xuất bán liên tục
Tiến hành: Lúc đầu, mẫu chiết và dung môi được nạp vào trong tất cả các thiết bị, mẫu được ngâm vào dung môi trong một khoảng thời gian xác định. Lúc này cả mẫu và dung môi đều không chuyển động. Sau đó dịch chiết được chuyển tuần tự từ thiết bị này sang thiết bị khác. Hệ thống tổ hợp kín các bình chiết này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ một trong những thiết bị ra khỏi hệ thống tuần hoàn, cho phép tháo phần bã ở bình đã được chiết kiệt rồi nạp mẫu mới. Sau đó, thiết bị này lại được đưa vào hệ thống tuần hoàn và dịch chiết đậm đặc nhất được dẫn qua nó mà dịch chiết này vừa đi qua tất cả các thiết bị còn lại. Tiếp theo, lại đóng ngắt một thiết bị kế tiếp mà trước đó dung môi vừa mới được dẫn qua. Ở đây, phần bã trước khi ra khỏi hệ thống thiết bị sẽ được tiếp xúc với dung môi mới nên dược liệu sẽ được chiết kiệt nên dịch chiết thu được sẽ đậm đặc nhất.
Ưu điểm: Dịch chiết đậm đặc. Dược liệu được chiết kiệt.
Nhược điểm: Hệ thống thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích lắp đặt. Vận hành phức tạp, thao tác thủ công.
Không tự động hoá quá trình được.
2.3.2.3. Phương pháp chiết xuất liên tục
Tiến hành: Phương pháp này được thực hiện trong những thiết bị làm việc liên tục. Ở đây, mẫu chiết và dung môi liên tục được đưa vào và chuyển động ngược chiều nhau trong thiết bị. Mẫu chiết di chuyển được trong thiết bị là nhờ cơ cấu vận chuyển chuyên dùng khác nhau. Dịch chiết trước khi ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với mẫu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc. Bã trước khi ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã được chiết kiệt.
Ưu điểm: Năng suất làm việc cao, tiết kiệm thời gian chiết. Không phải lao đông thủ công (tháo bã, nạp liệu).
Dịch chiết thu được đậm đặc. Mẫu chiết được chiết kiệt.
Dung môi ít tốn kém. Có thể tự động, cơ giới hoá được quy trình.
Nhược điểm: Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền. Vận hành phức tạp.
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
Nồng độ của dịch trích ly
Khi nồng độ các chất hòa tan trong dung môi thấp thì lượng chất trích ly từ nguyên liệu tăng, thời gian trích ly giảm. Vì vậy để đảm bảo quá trình trích ly tốt người ta thường thực hiện tăng tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu.
Đặc điểm của nguyên liệu
Khi kích thước nguyên liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt nguyên liệu, hoạt chất khó được chiết vào dung môi. Khi độ mịn nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn. Tuy nhiên trong thực tế, nếu xay nguyên liệu quá mịn sẽ gây ra một số bất lợi cho quá trình chiết xuất như sau: Khi ngâm nguyên liệu vào dung môi, bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau, tạo thành dạng bột nhão, vón cục. Do đó sẽ khó khuấy trộn giữa nguyên liệu và dung môi, quá trình chiết xuất xảy ra bị chậm lại. Mặt khác, vì bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy được.
Nhiệt độ
Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:
- Đối với những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá huỷ một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid ...
độ tan của tạp cũng đồng thời tăng theo, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp. Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy...khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở; tinh bột bị hồ hoá, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế.
- Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi.
- Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hoà tan toả nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại bị giảm. Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ.
Từ những phân tích trên ta thấy tuỳ từng trường hợp cụ thể mà cần lựa chọn nhiệt độ sao cho phù hợp (tuỳ thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất ...). Dựa vào nhiệt độ chiết xuất người ta chia ra làm 2 phương pháp là chiết nóng (nhiệt độ dao động từ 40-60oC) và chiết nguội (nhiệt độ khoảng 25oC).
Thời gian
Thời gian cũng là một yếu tố có tính quyết định trong việc thu hồi hoạt chất trong nguyên liệu. Trong quá trình chiết, lúc đầu các phân tử nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước sau đó mới tới các hợp chất phân tử lớn (thường là hợp chất keo, nhựa…). Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất. Nhưng nếu thời gian chiết quá dài dịch chiết có nhiều tạp chất sẽ gây khó khăn cho quá trình tinh chế sau này. Ngoài ra, thời gian chiết dài còn gây hao phí năng lượng. Vì vậy, vấn đề khảo sát để lựa chọn thời gian chiết là rất quan trọng. Thông thường thì người ta thường chiết xuất trong 24-72h.
Khuấy trộn
Khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu, hoà tan chất tan, chất tan sẽ khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi qua
màng tế bào. Sau một thời gian khuếch tán, nồng độ chất tan trong tế bào giảm dần, nồng độ chất tan trong lớp dung môi tăng dần, chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào giảm dần, tốc độ quá trình khuếch tán cũng giảm dần, đến một lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân bằng động giữa hai pha. Như vậy, nếu không có khuấy trộn, quá trình khuếch tán sẽ xảy ra rất chậm.
Do đó muốn tăng cường quá trình khuếch tán, cần phải tạo ra chênh lệch nồng độ giữa 2 pha. Điều này được thực hiện bằng cách khuấy trộn. Như vậy bằng cách khuấy trộn, người ta đã tăng cường được tốc độ khuếch tán. Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà người ta chọn loại cấu tạo cánh khuấy và tốc độ khuấy sao cho phù hợp.
2.4. Vi sinh vật gây bệnh và gây hư hỏng cho thực phẩm
Thực phẩm, vi sinh vật và con người có mối liên hệ mật thiết hết sức thú vị với nhau từ rất lâu. Thực phẩm không chỉ có giá trị dinh dưỡng đối với con người mà còn là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật. Vi sinh vật có thể được sử dụng để biến thực phẩm thô thành thực phẩm ưa thích như phomat, dưa chua, sữa chua, nước mắm…Ngược lại, thực phẩm cũng đóng vai trò như một phương tiện truyền bệnh. Sự phát hiện, kiểm soát mầm bệnh và các vi sinh vật làm hỏng thực phẩm hiện đang là những vấn đề được quan tâm. Trong toàn bộ chuỗi vận chuyển thực phẩm, từ người sản xuất đến người tiêu thụ, vi sinh vật có thể ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng thực phẩm và sức khỏe con người.
Vì thực phẩm là nguồn dinh dưỡng dồi dào, nên nếu có điều kiện bên trong và điều kiện bên ngoài thích hợp, vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh chóng, biến những thực phẩm bổ dưỡng và ngon miệng trở nên có vị chua, có mùi hôi hay được bao phủ bởi nấm. Rau xanh thường bị hư hỏng do vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây thối Erwinia carotovora tiết enzyme thủy phân cacbohydrat. Đối với các sản phẩm từ cam quýt được chế biến đông lạnh thì việc làm hỏng chủ yếu là do Lactobacillus và Leuconostoc gây ra. Nấm men
Saccharomyces và Candida cũng có thể làm hỏng nước ép trái cây.
Vi nấm là vấn đề đặc biệt của cà chua. Thậm chí khi chỉ thấy vết thâm nhẹ nhất trên vỏ cà chua, nhưng nếu bóc ra sẽ thấy sự sinh trưởng của nấm. Những chi nấm gặp thường xuyên bao gồm Fusarium, Stemphylium,
Cladosprorium. Sự sinh trưởng của chúng làm ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm cà chua.
Vi nấm cũng có thể sinh trưởng trên những hạt ngũ cốc nếu bảo quản trong điều kiện ẩm ướt. Sự xâm nhập của Claviceps purpurra vào hạt gây ra sự nhiễm độc ergotin. Ngũ cốc và những thực phẩm chứa ngũ cốc hay bị nhiễm Fusarium moniliforme, fumonisin do nấm này sinh ra gây bệnh viêm chất trắng ở não ngựa, phù phổi ở lợn và ung thư thực quản ở người.
Các bệnh dẫn đến từ thực phẩm có ảnh hưởng toàn cầu. Có 2 loại cơ bản về bệnh liên quan đến thực phẩm là bệnh lây nhiễm từ thực phẩm và sự nhiễm độc thực phẩm. Hiện nay được biết các virut Norwalk, vi khuẩn
Campylobacter jejuni và Salmonella là các nguyên nhân chính gây bệnh từ thực phẩm. Ngoài ra vi khuẩn Escherichia và Listeria cũng là các tác nhân gây bệnh liên quan đến thực phẩm rất đáng chú ý. Phòng chống nhiễm E. coli
vào thực phẩm là điều vô cùng quan trọng từ khâu sản xuất cho đến khâu tiêu thụ. E. coli có thể nhiễm vào thịt tươi và các sản phẩm gia nhiệt không đủ; các thực phẩm trải qua nhiều thao tác như salad; các sản phẩm từ sữa không được thanh trùng hoặc lây nhiễm sau khi thanh trùng. Sự nhiễm độc từ thực phẩm có liên quan đến sự sinh trưởng của vi sinh vật, tạo ra các độc tố dẫn đến ngộ độc thực phẩm. Có 3 loại trực khuẩn Gram dương là nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm là Clostridium botulinum, Clostridium perfringens và
Bacillus cereus. Bacillus cereus là mối lo lắng cho thực phẩm chứa tinh bột, chúng có thể gây ra các loại bệnh khác nhau phụ thuộc loại độc tố sinh ra: Một loại gây nôn còn một loại gây tiêu chảy, loại gây nôn thường xuất hiện trong cơm, trong khi loại gây tiêu chảy thường xuất hiện trong nhiều loại thực
phẩm khác nhau như thịt, hải sản, sản phẩm ngũ cốc, thực phẩm đóng hộp, rau, thảo mộc, gia vị sấy khô, nước sốt… Bacillus cereus phân bố rộng trong đất, nước, bụi, không khí…nó có thể sinh bào tử và sống sót trong tất cả các giai đoạn của quá trình chế biến. Vì vậy nó là mối lo lắng đáng kể trong vấn đề an toàn thực phẩm.
Trong ngành rau quả, thiệt hại do vi sinh vật gây ra chủ yếu bắt nguồn từ các loại nấm mốc. Hiện nay các loại nấm mốc gây hại rất đa dạng, trong đó phải kể đến Penicillium là một trong những loài nấm mốc phổ biến gây hỏng trên các loại trái cây (Alferez và cs., 2012). Các chủng nấm mốc thuộc họ
Penicillium có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp vì vậy chúng thường được tìm thấy trên thực phẩm, trái cây bảo quản dưới điều kiện lạnh (Morales và cs., 2010), ngoài ra chúng còn gây hư hỏng ở ngũ cốc, bánh mỳ, thịt. Các chủng P. digitatum và P. italicum xuất hiện trên các loại quả thuộc họ citrus (cam, quýt…) gây bệnh mốc xanh chiếm hơn 65% các hư hỏng trên quả và là bệnh sau thu hoạch gây hại nghiêm trọng trên các loại quả thuộc họ cam quýt
(Alferez, và cs 2012). Các chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus thường lây nhiễm trên các loại ngũ cốc, lạc, hạt bông, cây đậu và đậu nành, và chúng bị nhiễm ngay cả trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu những loại nông sản thực phẩm không được bảo quản đúng cách. Các loại nấm từ đất cũng ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của các sản phẩm nông nghiệp như nấm thuộc họ Botrytis cinerea, Trichoderma spp.,
Mycorrhizal và Mucor, thường lây nhiễm trong quá trình thu hoạch quả và phát triển mạnh mẽ trong quá trình bảo quản trên một số loại quả như quả vải, quả thanh long…(Jiang và cs., 2002; Kinay và cs., 2005)
PHẦN THỨ BA
VẬT LIỆU- NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu
Bột 3 loại lá sen được thu nhận từ lá sen theo ở 3 độ tuổi khác nhau (lá non, lá bánh tẻ, lá già). Lá sen được thu hoạch từ tháng 6 đến tháng 8/2014 tại tỉnh Bắc Ninh. Lá sen được lấy tại các khu hồ lớn, cách xa đường quốc lộ, xung quanh không có khu công nghiệp, không gần bệnh viện hoặc nơi vứt bỏ rác thải. Nguyên liệu sau khi thu hái được bỏ cuống, rửa sạch, cắt sợi chiều rộng ~ 0,5 cm, sấy khô ở 600C để độ ẩm đạt 5-7% và nghiền thành bột mịn rồi gói vào túi PE để bảo quản. Bột lá sen thu được sau đó sẽ dùng các dung môi khác nhau để chiết (cách chiết trình bày cụ thể ở phần phương pháp).
- Bốn chủng vi sinh vật: Penicillium italicum, Escherichia coli, Bacillus cereus, Aspergillus niger được cung cấp bởi viện CNSH-Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam;
- Môi trường dùng trong nghiên cứu:
Môi trường LB (g/l): Dùng trong giai đoạn hoạt hóa và nuôi cấy vi khuẩn E.coli và vi khuẩn B.cereus. Thành phần môi trường (g/l) gồm có cao nấm men (5g), peptone (10g), NaCl (10g), nước cất (1000ml)
Môi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, pH = 7.
Môi trường PDA (g/l): Dùng trong giai đoạn nuôi cấy nấm mốc
A.niger, P.italicum. Thành phần môi trường (g/l) gồm có khoai tây (200g), đường glucose (20g), thạch agar (20g), nước cất (1000ml)
Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH = 7.
- Hóa chất sử dụng: Cồn 96o, nước cất, ammoni hydroxit (NH4OH), acid clohydric (HCl 10%), NaOH, ether, ethyl acetat, acid oleanolic, vanillin, H2SO4 đặc, KMnO4, dung dịch FeCl3, dung dịch indigocarmin.
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: 8/2014-1/2015.
- Xác định thành phần và hàm lượng hoạt chất có trong lá sen ở các độ tuổi khác nhau để chọn được loại lá sen thích hợp;
- Xác định điều kiện chiết xuất phù hợp để thu nhận dịch chiết lá sen; - Xác định khả năng kháng vi sinh vật từ dịch chiết lá sen.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Quy trình công nghệ
Dự kiến quá trình thu nhận dịch chiết lá sen:
Hình 3.1: Dự kiến quy trình đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của