độ tuổi
- Xác định độ ẩm là một phần không thể thiếu làm tiền đề cho việc tính tốn, đánh giá về sau. Nguyên liệu sau khi thu hái, được sơ chế như trình bày trong mục 3.3.1. Để lựa chọn nguyên liệu thích hợp nhất cho mục đích kháng vi sinh vật từ dịch chiết lá sen, chúng tôi tiến hành phân tích các thành phần hoạt chất chính của 3 loại lá. Việc nghiên cứu xác định các hoạt chất sinh học có trong lá sen có ý nghĩa hết sức quan trọng, giúp lường trước sự ảnh hưởng của chúng đến khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết lá sen. Cách thức tiến hành thí nghiệm được thực hiện theo mục 3.3.3., hàm lượng các hoạt chất sinh học trong nguyên liệu lá sen ở 3 độ tuổi lá được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phân tích độ ẩm và hàm lượng các hoạt chất của lá sen ở các độ tuổi Độ tuổi lá Chỉ tiêu (%) Lá non Lá bánh tẻ Lá già Độ ẩm 6,44a 5,33c 5,44b Alkaloid 0,89a 0,85b 0,78c Flavonoid 3,25b 2,93c 3,39a Tannin 0,24a 0,20b 0,23a Saponin 4,85a 2,75b 0,50c
Số liệu trong cùng một hàng có chữ ở mũ khác nhau (a, b, c) là khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Nhận xét:
Kết quả bảng 4.1. cho thấy:
- Độ ẩm: Độ ẩm trung bình của nguyên liệu lá sen khơ của 3 loại lá tính theo
bảo quản nguyên liệu. Xác định độ ẩm là công việc đầu tiên phải làm khi tiến hành xác định những thành phần khác của nguyên liệu. Hàm lượng các chất đều được quy định tính trên trọng lượng khơ của ngun liệu.
- Alkaloid: Hàm lượng akaloid có sự khác nhau giữa 3 độ tuổi của lá sen. Hàm lượng alkaloid trong lá non cao nhất 0,89%, sau đó đến lá bánh tẻ 0,85% và thấp nhất ở lá già là 0,78%. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với kết quả của tác giả Đỗ Tất Lợi và cộng sự (2005) chỉ ra rằng trong lá sen có khoảng 15 loại alkaloid và hàm lượng alkaloid toàn phần vào khoảng 0,77- 0,84%. Một nguyên liệu chứa 1-3% alkaloid đã được coi là có hàm lượng alkaloid khá cao. Hàm lượng alkaloid trong lá sen tuy chỉ ở mức vừa phải nhưng lá sen là loại thực vật có lượng sinh khối rất lớn, lại chưa được ứng dụng nhiều nên có thể sử dụng cho mục đích thu nhận dịch chiết, tạo các chế phẩm bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên.
So sánh hàm lượng alkaloid trong lá sen với kết quả của Nguyễn Thị Nhung (2001) nghiên cứu về hàm lượng alkaloid trong tâm sen và gương sen, chúng tôi nhận thấy, hàm lượng alkaloid trong lá sen cao hơn rất nhiều so với trong gương sen là 0,24% nhưng lại thấp hơn hàm lượng alkaloid trong tâm sen là 1,23%.
- Flavonoid: Hàm lượng flavonoid trong lá non và lá già có sự sai khác không lớn, cao nhất là ở lá già 3,39%, sau đó đến lá non 3,25% và thấp nhất ở lá bánh tẻ là 2,93% .
- Tannin: Hàm lượng tannin trong lá sen tương đối thấp, cao nhất ở lá non, sau đó đến lá già và thấp nhất ở lá bánh tẻ. Sai khác về hàm lượng tannin giữa lá non và lá già là không đáng kể. So sánh với kết quả mà Đỗ Tất Lợi và cộng sự công bố năm 2005, hàm lượng tannin trong lá sen là 0,2-0,3% thì kết quả mà chúng tơi nghiên cứu được là hồn tồn phù hợp. Hàm lượng tannin trong lá sen tương đối thấp so với một số loại dược liệu khác như: chè vằng (6,23%), rau má (5,2%), ớt (5,19%), diếp cá (2,08%). Kết quả hàm lượng tannin giảm dần theo độ tuổi lá phù hợp với kết quả mà các nghiên cứu trước
đó trên chè đã cơng bố: hàm lượng tannin cao nhất ở búp 12%, giảm dần ở lá non 5%, lá già chỉ còn 3,5% tannin.
- Saponin: Hàm lượng saponin cao nhất ở lá non 4,85%, giảm xuống đáng kể ở lá bánh tẻ 2,75% và chỉ còn một hàm lượng rất nhỏ ở lá già. So sánh với kết quả của Anthony và cộng sự năm 2013 thì hàm lượng saponin tương đối thấp khi chiết với acetone, hàm lượng saponin cao nhất khi chiết với dung môi nước.
Kết luận: Từ các nhận xét trên, chúng tôi thấy lá sen non là loại lá chứa
hàm lượng alkaloid, tannin, saponin cao nhất trong 3 loại lá. Vì thế, chúng tơi lựa chọn độ tuổi lá sen là lá sen non để tiến hành thu nhận dịch chiết cho các thí nghiệm sau.
4.2. Kết quả xác định điều kiện phù hợp để thu nhận dịch chiết lá sen có hoạt chất cao
4.2.1. Kết quả xác định dung môi chiết
Dung mơi là một yếu tố có vai trị quyết định trong q trình chiết. Mỗi dung mơi có khả năng hịa tan các hợp chất khác nhau ở các mức độ khác nhau. Dung mơi chiết có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng trích ly các chất ra khỏi nguyên liệu. Mỗi loại dung mơi khác nhau có khả năng hịa tan các hơp chất khác nhau, ở các mức độ khác nhau. Vì vậy, việc lựa chọn dung mơi có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi các hợp chất. Độ phân cực của dung môi, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi là những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất. Theo các tài liệu tham khảo, lá sen chứa lượng lớn các chất tương đối phân cực và phân cực (Văn Quốc Hồng 2012), vì thế thường sử dụng các hợp chất có độ phân cực mạnh như ethanol, methanol làm dung mơi chiết xuất. Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát hiệu quả thu nhận dịch chiết của một số loại dung môi: ethanol, methanol, và ethyl acetate với cùng điều kiện chiết như sau: nhiệt độ chiết là nhiệt độ 50oC và thời gian chiết là 48h. Thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả khảo sát thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỉ lệ cặn chiết xác định theo dung môi chiết xuất
Khối lượng cặn chiết (g) Tỉ lệ cặn chiết (%)
Ethyl acetate 0,49c 2,45c
Ethanol 2,06b 10,31b
Methanol 2,41a 12,08a
Số liệu trong cùng một cột có chữ ở mũ khác nhau (a, b, c ) là khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%
Nhận xét:
Kết quả phân tích cho thấy, methanol có khả năng cho hiệu suất chiết xuất tốt hơn ethanol. Ethyl acetate hòa tan các hoạt chất trong dịch chiết rất kém 2,45%. Nguyên nhân của sự khác biệt trong hiệu suất thu nhận dịch chiết của 3 loại dung môi trên là do bản chất của các loại dung môi. Mặc dù ethanol và methanol đều là các loại dung mơi có tính phân cực mạnh thường được sử dụng trong nhiều nghiên cứu chiết xuất các hợp chất phân cực của lá sen nhưng xét về độ phân cực (tính bằng hằng số điện mơi) thì hằng số điện mơi của methanol (33) cao hơn hằng số điện mơi của ethanol (24,55), do đó chính độ phân cực cao hơn của methanol dẫn đến hiệu suất chiết xuất cao hơn ethanol. Kết quả cũng cho thấy dung môi ethyl acetate cho hiệu suất chiết xuất khá thấp, nguyên nhân là do ethyl acetate về bản chất có độ phân cực tương đối thấp (hằng số điện môi là 6,02).
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Văn Quốc Hồng được cơng bố vào năm 2012 cùng với đề tài “Khảo sát thành phần hóa học của lá sen được thu hái ở huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam”, Trường Đại học Đà Nẵng, chúng tôi nhận thấy hiệu suất chiết thu nhận được của ethyl acetate có sự tương đồng với kết quả của tác giả Văn Quốc Hoàng, tuy nhiên, hiệu suất chiết của methanol lại có sự khác biệt. Có sự khác biệt này có thể là do hàm lượng hoạt chất sinh học trong dịch chiết ngoài phụ thuộc vào loại dung mơi chiết thì nó cịn chịu ảnh hưởng lớn từ địa điểm lấy mẫu, độ tuổi lá khảo sát… Hiệu suất chiết của methanol là tương đối cao 12,08%.
Nhưng methanol có tính độc mạnh đối với con người nên chúng tôi quyết định chọn ethanol làm dung môi chiết xuất. Ethanol lại có nhiều ưu điểm hơn như: khơng gây độc nên an tồn cho sức khỏe con người, lại dễ kiếm, rẻ tiền. Hơn nữa, hiệu suất chiết xuất thu nhận từ hai dung môi này chênh lệch khơng q lớn. Ngồi ra, có thể giảm độ nhớt của dung mơi ethanol bằng hệ dung mơi ethanol-nước để có hiệu suất cao hơn.
Kết luận: Từ các nhận xét trên, chúng tôi nhận thấy nên lựa chọn
ethanol để tiến hành chiết xuất thu nhận dịch chiết từ lá sen.
4.2.2. Kết quả xác định số lần chiết xuất
Số lần chiết ảnh hưởng đến hàm lượng các hoạt chất có trong dịch chiết thu hồi được. Từ kết quả khảo sát, đã biết được dung mơi cồn là dung mơi thích hợp nhất để thu nhận dịch chiết. Và qua quá trình tham khảo tài liệu “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc” (Hồng Thị Tuyết Nhung,
2012), chúng tơi đã làm trên các điều kiện phù hợp để tách chiết thu được hiệu
suất cao nhất
Ở đây, chúng tôi tiến hành khảo sát với số lần chiết lần lượt là 1, 2, 3 lần. Kết quả xác định số lần chiết thích hợp được thể hiện qua bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tỉ lệ cặn chiết thu nhận theo số lần chiết xuất
Khối lượng cặn chiết (g) Tỉ lệ cặn chiết (%)
Chiết 1 lần 2,07c 10,35c
Chiết 2 lần 2,48b 12,44b
Chiết 3 lần 2,56a 12,84a
Nhận xét:
Dựa vào kết quả bảng ta thấy số lần chiết khác nhau thì hiệu suất dịch chiết thu được cũng khác nhau. Hiệu suất chiết cao nhất khi số lần chiết là 3 lần với hiệu suất 13,84%, sau đó là chiết 2 lần và thấp nhất ở chiết 1 lần 10,35%. Số lần chiết càng tăng thì hiệu suất chiết tăng. Lá sen có cấu trúc lỏng lẻo, các hoạt chất sinh học chủ yếu tập trung giữa các không bào, được
bao bọc bởi lớp Cellulose và Lipoprotein. Cho nên chỉ cần phá vỡ lớp cấu trúc này thì sẽ dễ dàng thu nhận được hoạt chất sinh học. Q trình phơi khơ nhằm tăng hàm lượng chất khô tuyệt đối (tăng nồng độ các hoạt chất), phá vỡ cấu trúc tế bào nguyên liệu tạo điều kiện cho dung mơi ngấm sâu vào trong ngun liệu từ đó làm tăng hiệu quả chiết.
Khi tăng số lần chiết hàm lượng dịch chiết tăng. Thực hiện chiết lần 2 hàm lượng dịch chiết tăng lên, nhưng thực hiện chiết lần thứ 3 thì tổng hàm lượng dịch chiết thu được có cao hơn so với chiết lần thứ 2 nhưng không cao hơn nhiều. Khi tăng số lần chiết (>2) hàm lượng dịch chiết thu được không đáng kể, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế (lãng phí năng lượng, tốn nhân cơng, tốn thời gian). Do đó chọn số lần thu nhận dịch chiết 2 lần là phù hợp nhất.
Kết luận: Từ nhận xét trên kết hợp với so sánh hiệu quả, thời gian, chi phí
giữa chiết 2 lần và chiết 3 lần, chúng tơi chọn chiết 2 lần để tiến hành thu nhận dịch chiết lá sen.
4.2.3. Xác định thời gian và nhiệt độ chiết xuất
Trong q trình trích ly người ta thường tiến hành trích ly ở nhiệt độ gần bằng điểm sơi của dung mơi. Trong trường hợp chất cần trích ly có tính chịu nhiệt tốt, khơng phân hủy ở nhiệt độ cao thì nhiệt độ càng cao, hiệu suất trích ly càng lớn. Tuy nhiên nếu nhiệt độ trích ly cao sẽ dẫn đến việc hao tổn nhiên liệu lớn, hiệu quả kinh tế thấp, đó là chưa kể đến việc nhiệt độ trích ly cao bằng nhiệt độ sơi của dung mơi có khả năng tràn trào, gây khó khăn trong thao tác. Do các hoạt chất sinh học thường là các hợp chất không bền với nhiệt nên việc khảo sát nhiệt độ trích ly được thực hiện ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sơi của ethanol là 79oC. Ngồi nhiệt độ thì thời gian cũng ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất thu nhận dịch chiết, thơng thường thời gian trích ly dài thì chất tan khuếch tán vào dung môi càng nhiều, tuy nhiên việc kéo dài cơng đoạn trích ly sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất và hiệu quả kinh tế. Nguyên
nhân là do trong quá trình chiết các phân tử nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung mơi trước sau đó mới đến các hợp chất có phân tử lớn (thường là hợp chất keo, nhựa…). Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ khơng chiết được hết hợp chất cần thiết. Nhưng nếu thời gian qua dài, dịch chiết có thể chứa nhiều tạp chất, lượng dung mơi tổn thất nhiều hơn, làm giảm hiệu quả chiết. Vì thế với mục đích tìm ra nhiệt độ và thời gian chiết xuất thích hợp, nghĩa là vừa cho hiệu quả kinh tế cao, vừa đảm bảo hiệu suất trích ly mà thao tác lại thuận tiện, an tồn, tiết kiệm thời gian, cơng sức…đề tài tiến hành trích ly ở các nhiệt độ 20, 30, 40, 50, 60oC kết hợp với các khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 60h.
Từ kết quả khảo sát từ các thí nghiệm trên, chúng tơi xác định được dung mơi thích hợp nhất để thu nhận dịch chiết là dung môi cồn, số lần chiết để thu được hiệu quả cao là chiết 2 lần.
Ở đây chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian và nhiệt độ chiết xuất để tìm ra nhiệt độ và thời gian chiết xuất thích hợp, kết hợp với loại dung mơi, số lần chiết tìm ra được ở các thí nghiệm trên, rút ra điều kiện chiết xuất cho hiệu quả cao nhất. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4.
Nhiệt độ chiết (oC)
Thời gian chiết (h)
20 30 40 50 60 12 6,33Ee 7,65Ce 7,22De 8,73Ae 8,64Bc 24 7,39Ed 7,72Dd 7,88Cd 8,4Bd 8,43Ad 36 7,48Ec 7,74Dc 8,27Cc 8,41Bc 9,27Ab 48 7,95Ea 8,51Da 8,63Ca 10,45Aa 9,73Ba 60 7,87Db 7,82Eb 8,3Cb 9,3Ab 8,64Bc
Số liệu trong cùng một hàng có chữ ở mũ khác nhau (A, B, C, D, E ) là khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Số liệu trong cùng một cột có chữ ở mũ khác nhau (a, b, c, d, e) là khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Nhận xét:
- Từ bảng trên, có thể thấy nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng rõ rệt hiệu
suất thu nhận dịch chiết.
- Khi tăng nhiệt độ từ 20oC đến 50oC thì hiệu suất dịch chiết thu nhận được cũng tăng từ 6,33% đến 8,73% đối với khoảng thời gian chiết 12h, từ 7,95% đến 9,3% đối với khoảng thời gian 60h. Nhưng khi tăng tiếp nhiệt độ lên 60oC thì hiệu suất dịch chiết thu được lại giảm. Điều đó chứng tỏ nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới hàm lượng các hoạt chất sinh học trong dịch chiết. Ở nhiệt độ 50oC cho hiệu suất chiết cao nhất trong số các nhiệt độ thử nghiệm. Đối với q trình trích ly ở nhiệt độ thấp nhất 20oC, không thúc đẩy mạnh sự hịa tan các chất vào dung mơi nên hàm lượng chất chiết rút được ít, hiệu suất trích ly là thấp nhất. Ngược lại tuy nhiệt độ cao làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình chiết nhưng khi nhiệt quá cao sẽ làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt, dung môi bị hao hụt nhiều, giảm tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu nên dẫn đến hiệu quả chiết giảm, đồng thời việc gia tăng nhiệt độ có thể dẫn đến sự phá hủy các chất như alkaloid, flavonoid…và hịa tan các tạp chất có trong ngun liệu gây cản trở cho quá trinh nghiên
cứu. Ở 50oC hàm lượng dịch chiết thu nhận được là cao nhất nên đây là nhiệt độ thích hợp cho chiết xuất.
- Nghiên cứu cho thấy hiệu suất chiết tăng dần từ 12h đến 60h ở các điểm nhiệt độ 20, 30, 40oC nhưng khi kéo dài thời gian hơn nữa thì hiệu suất chiết lại giảm đi. Như vậy thời gian chiết có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu nhận dịch chiết. Khi thời gian trích ly tăng từ 12h đến 48h thì hàm lượng dịch chiết hay chính là hiệu suất chiết tăng nhanh từ 6,33% đến 7,87% (đối với điểm nhiệt độ 20oC), tăng từ 8,64% đến 9,73% đối với điểm nhiệt độ 60oC. Nguyên nhân của hiện tượng này là do khi thời gian ngắn thì khơng đủ thời gian để hịa tan hết hàm lượng các hoạt chất sinh học trong lá sen, còn khi thời gian kéo dài thì lại thừa thời gian dẫn đến dịch chiết có nhiều tạp chất, lượng dung