3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Phương pháp phân tích-đánh giá-xử lý số liệu
3.3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng cách sấy đến khối lượng không đổi Nguyên tắc: Khi sấy ở nhiệt độ cao (105oC) trong thời gian dài lượng nước
trong nguyên liệu sẽ bay hơi dần và khi lượng nước bay hơi tồn bộ cịn lại phần chất khô không bay hơi. Cân khối lượng trước và sau sấy, dựa vào sự chênh lệch khối lượng ta sẽ biết khối lượng nước trong vật liệu cần xác định độ ẩm.
Tiến hành: Sấy khô cốc ở 105oC, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân khối lượng bằng cân phân tích. Cân chính xác 3-5 g mẫu cần xác định độ ẩm cho vào cốc. Cân khối lượng cả cốc và mẫu sau đó đem sấy ở nhiệt độ 105oC. Sau 1h lấy mẫu ra, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Tiếp tục cho vào sấy, sau 30 phút lặp lại thí nghiệm như trên. Tiến hành lặp lại nhiều lần đến khi sự chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân khơng q 0,05 g thì dừng lại.
Kết quả: Độ ẩm nguyên liệu:
Trong đó: m1: Khối lượng cốc sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu tươi m3: Khối lượng cốc và mẫu sau sấy
3.3.3.2. Xác định hàm lượng các hoạt chất của lá sen ở các độ tuổi - Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân.
Nguyên tắc: Phương pháp cân được sử dụng để xác định hợp chất toàn
phần hay lượng sản phẩm chiết được, qua đó tính được hiệu suất của q trình. Đây là phương pháp đơn giản, thường được sử dụng để định lượng alkaloid.
Tiến hành: Chiết bằng cồn (CH3CH2OH) tẩm amoniac (NH4OH)
Cân khoảng 100g bột lá sen. Thấm ẩm bột bằng 50 ml NH4OH 10%. Cho 500 ml dung môi ethanol 95% vào đến khi ngập bột lá sen. Ngâm trong 24h.
Rút dịch chiết và lọc. Tiếp tục chiết bằng cồn đến khi dịch chiết trong (3 lần). Mỗi lần bổ sung 25 ml cồn và ngâm trong 8h. Gộp dịch chiết và đem lọc. Cất thu hồi cồn, cô quay chân không đến khi thu được cặn nhão.
Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 10% đến khi pH = 2, khuấy kĩ. Sau đó kiềm hóa bằng dung dịch kiềm NaOH đến pH = 9-10, chiết alkaloid bằng cloroform (theo tỷ lệ dịch thu được/ cloroform lần lượt là 1 : 1 (v/v), cất thu hồi dung mơi, thu được alkaloid tồn phần.
Kết quả: Hàm lượng alkaloid tồn phần được tính theo cơng thức:
X% = *100 *(1 )
n m ha
Trong đó:
X: Hàm lượng alkaloid toàn phần
n: Khối lượng hợp chất toàn phần chiết xuất được m : Khối lượng mẫu đem chiết
ha: Hàm ẩm của nguyên liệu
- Định lượng flavonoid bằng phương pháp cân
Nguyên tắc: Phương pháp cân được sử dụng để xác định hợp chất toàn
phần hay lượng sản phẩm chiết được, qua đó tính được hiệu suất của q trình. Đây là phương pháp đơn giản, chủ yếu được sử dụng để đánh giá hiệu suất chiết.
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 8g bột lá sen chiết bằng 100 ml
ethanol 96o trong dụng cụ Soxhlet. Đun liên tục trong 8 giờ thu được dịch chiết ethanol. Thu hồi ethanol, hòa tan cặn chiết trong 20 ml nước cất đun nóng. Lọc nóng qua giấy lọc, cho dịch lọc vào bình gạn, loại tạp bằng 20 ml ether dầu hỏa.Sau đó chiết bằng 20 ml ethylacetat. Lắc nhẹ trong 5 phút, để yên, gạn lấy phần ethyl acetat. Chiết tiếp 4 lần nữa mỗi lần 20 ml ethyl acetat. Gộp 5 dịch chiết cho vào cốc đã cân bì trước, bốc hơi thu được cắn, sấy cắn ở 70oC đến khối lượng khơng đổi, cân.
Kết quả: Hàm lượng flavonoid tồn phần theo công thức sau:
X% = *100 *(1 )
n m ha
Trong đó:
X: Hàm lượng flavonoid tồn phần
n: Khối lượng hợp chất toàn phần chiết xuất được m : Khối lượng mẫu đem chiết
ha: Hàm ẩm của nguyên liệu
- Xác định saponin tổng số bằng phương pháp cân khối lượng
Phương pháp định lượng saponin trong dịch chiết lá sen:
Cân chính xác khoảng 5g bột lá sen khơ đã xác định độ ẩm cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxlet, chiết bằng chloroform để loại chlorophyl. Sau đó chiết bằng methanol cho tới khi phản ứng âm tính với acid sunfuric, lọc cất thu hồi dung mơi đến cịn khoảng 20ml, rót từ từ vào 100ml aceton, khuấy đều sẽ xuất hiện tủa, hịa tan tủa vào 50ml nước nóng, đun cách thủy cho tan hết. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, chiết saponin bằng n-butanol 8 lần, mỗi lần 25ml cho đến khi kiệt saponin. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy đến khô. Sấy cắn ở 105oC đến khối lượng khơng đổi. Cân rồi tính hàm lượng saponin trong lá sen theo công thức:
X(%) =
Trong đó: a là khối lượng cắn saponin thu được (g). d là độ ẩm bột lá sen khô (%).
m là khối lượng bột lá sen lấy định lượng (g).
- Định lượng tannin bằng phương pháp Lowenthal
Nguyên tắc: Tannin là hợp chất khử, khi bị oxy hóa bởi KMnO4 trong
mơi trường acid với chất chỉ thị indigocarmin sẽ tạo thành khí carbonic và nước, đồng thời làm mất màu xanh của indigocarmin theo phản ứng:
Tiến hành: Cân chính xác 2g lá sen khơ đã nghiền nhỏ cho vào bình cầu
cao đáy bằng hoặc bình tam giác chịu nhiệt 250ml. Thêm vào 100ml nước cất đun sôi, đặt vào trong nồi cách thủy, chiết xuất trong thời gian 40', để yên vài phút rồi lọc qua bơng vào bình định mức 250ml. Tiếp tục chiết cho đến khi dịch chiết khơng cịn phản ứng của tannin (thử với sắt III clorua). Làm nguội dịch chiết và thêm nước cất đến vạch, dung dịch chiết này dùng để xác định tannin. Dùng ống đong lấy 75ml nước cất cho vào bát sứ có dung tích 100ml và 2,5ml dung dịch indigocarmin 0,1% trong môi trường acid, dùng pipet lấy 1ml dịch chiết cho vào, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch Kali permanganat 0,1N nhỏ từng giọt một cách đều đặn, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi mất dần màu xanh và xuất hiện màu vàng rơm là được. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình.
Tính kết quả: Hàm lượng tannin được tính theo cơng thức sau:
Trong đó:
X: Hàm lượng tannin tính theo chất khơ (%)
V: Thể tích dịch chiết lá sen từ 2g mẫu nghiên cứu (250ml) v: Thể tích dung dịch chiết lấy ra để phân tích (1ml)
m: Số gam mẫu khô nghiên cứu
a: Số ml dung dịch kali permanganat 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm b: Số ml dung dịch kali permanganat 0,1N chuẩn độ mẫu đối chứng 0,00582 là hệ số tannin (cứ 1ml oxy hóa KMnO4 0,00582g hợp chất tannin)
3.3.3.4. Xác định kháng vi sinh vật của dịch chiết lá sen bằng phương pháp xác định đường kính vịng vơ khuẩn
Nguyên tắc: Dịch chiết lá sen được nhỏ vào các lỗ thạch trong môi
trường nuôi cấy, dưới tác dụng của hoạt chất kháng khuẩn sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật có sẵn trong mơi trường. Đo đường kính vịng vơ khuẩn,
từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá sen.
Bố trí thí nghiệm: Mỗi đĩa petri trang 1 chủng vi sinh vật. Trên mỗi đĩa
pettri tiến hành đục 5 lỗ, mỗi lỗ có đường kính 8mm, mỗi lỗ cách nhau ít nhất 15mm. Năm lỗ được nhỏ dịch chiết của lá sen ở 5 nồng độ khác nhau. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Tiến hành:
- Phương pháp hoạt hóa, chuẩn bị giống vi sinh vật
Vi sinh vật được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và được bảo quản lạnh. Từ ống tồn trữ, cấy 1 vòng que cấy vào ống nghiệm chứa 20ml mơi trường ni cấy (khơng có agar) đã khử trùng. Ni cấy ở 37oC trong vòng 24h.
- Chuẩn bị môi trường: Môi trường được sử dụng là môi trường LB để nuôi cấy vi khuẩn E. coli, B. cereus; môi trường PDA để nuôi cấy nấm mốc A. niger, P. italicum.
Chia mơi trường ra các bình tam giác 250ml, hấp khử trùng 121oC trong 2h. Để môi trường nguội xuống khoảng 40-45oC, đổ 25ml môi trường vào mỗi đĩa petri. Để thạch đơng, nhỏ 10µl vi sinh vật cho vào mỗi đĩa, trang đều trên toàn bộ bề mặt mơi trường. Khi bề mặt khơ thì tiến hành đục lỗ thạch bằng nút khoan, đường kính lỗ khoảng 8mm.
- Chuẩn bị dịch chiết lá sen
Dịch chiết được thu nhận theo các điều kiện chiết xuất tối ưu nhất (nhiệt độ, thời gian, dung môi, số lần chiết), sau khi dịch chiết, tiếp tục li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy dịch trong, mang đi cô quay hút chân khơng để loại bỏ hồn tồn dung môi. Dịch chiết đã được loại bỏ dung môi được bảo quản trong tủ mát 4oC. Tiến hành pha loãng 2g cặn chiết với 100ml nước cất, coi đó là nồng độ 100%, từ đó pha lỗng ra 4 nồng độ còn lại (20, 40, 60, 80%).
- Tiến hành
trùng. Các đĩa thạch có thể được để se mặt thạch trong tủ ấm 37oC/30 phút. Dùng micropipett 100µl với đầu típ vơ trùng, chuyển 60µl dịch chiết vào các lỗ trong đĩa petri. Sau đó để đĩa thạch trong tủ lạnh ở 4oC khoảng 2 giờ nhằm mục đích để dịch chiết khuếch tán đều vào trong thạch. Chuyển sang nuôi ở trong tủ ấm ở 37oC/24h.
Đọc kết quả: Sau 24h đọc kết quả. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết
lá sen được tính theo cơng thức (D-d). Trong đó: D: đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
PHẦN THỨ TƯ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN